醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.ppt
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质,山西大学生科院生化教研室,一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理二、实验原理电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状,采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白,实验原理,三、实验器材,1.DYY-2型常压电泳仪：北京市六一仪器厂生产，1套/2组。,操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上，。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改进为数显式的DYY-6C型。,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：2片/人。3.培养皿：一排桌子（即4组）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.点样器：一个/组。5.滤纸：公用。6.玻璃板：一块/组。7.镊子：一个/组。8.玻棒：公用。,四、实验试剂,1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，用蒸馏水定容至1000mL。2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。4透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇7份，冰醋酸3份，混匀。,五、实验操作浸泡：将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min方可用于点样点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线,电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥,电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min 染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱,卧式水平电泳槽,六、注意事项市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散操作过程为防止指纹污染，应戴手套,七、实验思考用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？,
