《生殖干细胞》PPT课件.ppt

在多细胞生物的胚胎发育过程中，原始生 殖细胞是最早分化出来的一群细胞，即生殖干细胞(germ stem cells)。这群细胞的出现，在多种动物中已证明与卵子内生殖质(germ plasm)的分布密切相关。由于在线虫、昆虫等生物的卵细胞内，其生殖质位于卵子的后极，故又称极细胞质或极质(pole plasm)，已于80多种动物(8个门)中发现了类生殖质成分的存在。,第二章 配子发生与发育前的准备,生殖质由RNA和蛋白质组成，均为母体效应基因转录或翻译的产物。在卵子发生过程中，不同生物的母体效应基因以多种方式被激活并进行高效表达，将大量产物储藏在卵母细胞内，为受精后迅速启动胚胎发育做了充分的物质准备。,2.1 配子发生,配子发生涉及到原始生殖细胞起源的方式、途径，参与调控、决定的有关基因。原始生殖细胞独立于性腺原基产生，但必须迁入性腺后才能完成增殖、生长和成熟等发育阶段。,原始生殖细胞的起源与决定,动物卵裂有多种方式和类型，因种类不同而存在明显的差异。然而，无论采用哪种卵裂方式，通过细胞不断分裂和增殖最终将导致细胞之间的分化，首先是原始生殖细胞从胚细胞中分化出来。,不对称细胞分裂能使所产生的两个子细胞出现发育途径的分歧；部分卵裂球内发生染色体消减而另一部分则保持完整会直接导致体细胞与种系细胞之间的分化；某些母体效应基因的转录、表达产物在卵子内局部差异分布对原始生殖细胞的形成具决定作用。,不对称细胞分裂与生殖细胞的起源,在某些动物的受精卵中，母体效应基因的产物如RNA和蛋白质所组成的RNP颗粒等发育决定因子呈不均匀的区域分布。当卵裂时，这些决定因子被不均等地分配到子细胞中，导致两个细胞具有不同的发育潜能并朝着不同方向演变。这种细胞分裂方式称为不对称细胞分裂(Asymmetrical cell division)。,在卵裂早期，每一次不对称分裂产生一个建立者细胞(Founder cell)和一个干细胞(stem cell)。前者将朝被决定的方向产生分化的细胞后代(体细胞或生殖细胞)，后者则继续通过不对称分裂形成新的建立者细胞和干细胞。这些建立者细胞是由卵子内的发育决定因子预先决定的，其子细胞将按既定的发育程序进行自主发育，不受环境变化的影响。,角贝的受精卵在第一次卵裂前期，于植物极伸出一个突起的泡状结构，称为极叶(Polar lobe)。第一次卵裂完成后，一个子细胞得到全部极叶的细胞质，另一个子细胞则不含极叶成分。第二次卵裂前期，含极叶的那个子细胞像第一次卵裂一样又产生两个不同的子细胞，而不含极叶的子细胞同样进行第二次卵裂。经过多次卵裂之后，凡获得含极叶细胞质的子细胞将分化成原始的生殖细胞，而不含极叶细胞质的子细胞将朝体细胞的方向分化。通过角贝卵裂过程中极叶的形态变化可以直接跟踪观察和证明不对称细胞分裂与原始生殖细胞起源之间的因果关系。,染色体消减,马蛔虫(Parascaris equorum)2n=4，是染色体数最少的一种多细胞动物。虽同为线虫，但马蛔虫原始生殖细胞的发生走的是另一条不同的途径。1904年，T.Boveri发现马蛔虫第二次卵裂前中期，动物极分裂球的染色体碎裂成断片且大多丢失，原来的染色体仅一部分保留下来。这种现象称染色体消减(Chromosome diminution)。这些细胞因此丢失了许多基因(Tobler et al.,1972)。与此同时，植物极分裂球的染色体却保持完整。,第三次分裂时，动物极细胞沿子午线分裂而植物极细胞仍沿赤道板分裂。然而第三次卵裂之前，靠近动物极的那个植物分裂球在分裂后期同样要进行染色体消减，故4细胞期唯有最植物极那个细胞才具有完整的染色体组。经过4次卵裂形成16个细胞后，其中仅2个细胞保持4条染色体完整，将成为生殖干细胞；其余细胞均含有消减染色体，便成为建立者细胞，朝体细胞的方向分化发育。,极质、极粒与生殖细胞决定,昆虫卵子后端的极细胞质与生殖细胞决定相关的现象最早由Hegner(1911)报道，他发现极细胞形成之前，若除去或毁坏甲虫卵的极细胞质区，胚胎发育就不能形成生殖细胞而导致成虫不育。Geigy(1931)证明，用UV照射果蝇卵的极细胞质则产生不育的果蝇。,Okada和同事(1974)将供体正常的未经辐射的极质注射到辐射过的受体卵的后端，结果能挽救果蝇的不育性。该项研究还表明，极质以其内含有颗粒状结构为特征，这些颗粒称为极粒或P颗粒(Polar granules)，而其它部位的细胞质则没有极粒，也不具有逆转其不育性的功能。由此可见，极质内的P颗粒直接与生殖细胞决定相关联。,关于极质的研究，近期主要集中于果蝇。果蝇的原始生殖细胞称为极细胞(Pole cell)，由数个细胞核迁移至卵后端极质内然后细胞化而成，是胚胎中最早分化形成的细胞。这些极细胞形成时，将极质内的极粒包裹于内。极粒含蛋白质和RNA，包括生殖细胞决定因子。这些决定因子是母体效应基因的产物，如oskar基因的表达产物OSKAR蛋白等。,若将OSKAR注射到卵子前端下方，可诱导极细胞在胚前端异位发生(Ectopic)，但前端产生的极细胞不能进入生殖腺。由此可见，合胞期的胚核是全能的，能分化成任何类型的细胞。达到后极的无论是哪些核，都是最早形成的细胞，并与极质相结合变成配子的前体。,果蝇极质的成份之一是无生殖细胞基因(germ cell-less,gcl)的mRNA。野生型gcl基因在成蝇卵巢中的滋养细胞内转录，其mRNA被输送进卵子的最后部，成为极质的一部分,并于卵裂早期翻译成蛋白质。相反，纯合突变蝇(gcl-gcl-)所产的卵子和胚胎中则检测不到该基因的产物。跟踪观察表明，gcl编码的蛋白质进入了细胞核内，它对于极细胞的产生至为关键。当把gcl信使的反义RNA导入胚内时，同样会失去产生生殖细胞的能力。,2.1.1.4 极粒的主要成分与母体效应基因,极质成份的第二组候选者是oskar和nanos等基因的产物，其中OSKAR蛋白最关键，因为将oskar mRNA注射到胚胎的其它部位就会导致该区域的细胞核形成异位的原始生殖细胞。OSKAR还与生殖细胞产生的数量有关，如果卵母细胞内的oskar mRNA增加就会形成更多的生殖细胞(Ephrussi and Lehmann 1992)。,OSKAR通过促成生殖细胞形成所必须的蛋白质和RNAs的定位而发挥作用，nanos mRNA是受其作用的RNA之一。NANOS是果蝇腹节形成所必需的，同时也是生殖细胞形成所必需的。没有NANOS的极细胞不能迁移进生殖腺，因而不能变成配子。,第三个候选者是线粒体的核糖体RNA(Mitochondrial ribosomal RNA，mtrRNA)。应用辐射检测系统，Kobayashi和Okada(1989)证明，向被UV照射过的胚胎导入mtrRNA可以恢复该胚胎形成极细胞的能力。在正常卵子内，mtrRNA仅位于卵裂期胚胎极质内线粒体的外侧，以极粒的成分出现。mtrRNA与介导极细胞的形成有关，但后来并没有进入极细胞内。,第四种极质成分是极粒组成部分但不翻译的一种RNA(Polar granule component,pgc)。虽然pgc的确切功能尚不清楚，但其反义DNA的转基因果蝇的极细胞不能迁进卵巢(Nakamura et al.,1996)，可能与原始生殖细胞向生殖嵴迁移有关。,是什么指引gcl mRNA、nanos mRNA和mtrRNA等成分定位到卵子的后端呢？至少还发现另外有6个基因发挥了作用，它们的突变体不能形成生殖细胞，而且也很少形成腹节。这些突变基因是cappucino,spire,staufen,vasa,valois和tuder。所有这些基因活跃于卵巢并将其产物输送到生长着的卵母细胞内。,极粒的装配由oskar 信使组织，该mRNA的数量和位置决定极细胞的数量和位置。来自仅有1份oskar拷贝的果蝇胚胎在细胞囊胚期产生10-15个极细胞，而双份拷贝的果蝇胚胎则可产生约35个极细胞，4拷贝就会形成约50个极细胞。Ephrussi和Lehmann(1992)还证明，生殖细胞将在oskar mRNA定位的任何地方形成。如果将oskar mRNA移至胚胎的前端，极质及原始生殖细胞将在前端形成。,OSKAR是极粒骨架的主要组分，VASA和TUDOR再附着到OSKAR上形成更复杂的空间结构并与生殖细胞决定子相结合(Breitwieser et al.1996)。gcl mRNA和mtlrRNA在卵后部的定位能够被前述种基因及oskar中的任何一种突变所消除。在valois和tudor突变体中，开始能发现少量gcl mRNA定位于早期胚胎的后端，但在卵裂后期便消失了。,雌雄配子的发生过程,前已述及，原始生殖细胞在多细胞动物的胚胎发育过程中是最早分化出来的一群细胞。这些细胞只有迁移进原始的生殖腺内继续发育才能成为成熟的配子。在脊椎动物胚胎发育早期，生殖嵴没有之分，同时具发育为卵巢或睾丸两种潜能，迁移进来的原始生殖细胞广泛分布于内部髓质和外部皮质。,如果胚胎为XY型，在主导基因sry作用下，皮质退化，其内的原始生殖细胞发生凋亡，而髓质分化为睾丸，其内的原始生殖细胞分化为精原细胞(spermatogonium)；若胚胎为XX型，没有Y染色体及sry，则髓质退化，其内的原始生殖细胞发生凋亡，而皮质发育为卵巢，其内的原始生殖细胞分化为卵原细胞(oogonium)。,2.2 发育前的准备,动物卵子受精之后，从卵裂至囊胚形成其细胞分裂速度很快，细胞周期没有G1期和G2期，只有S期和M期。在此过程中，合子基因组几乎是不活动的，那么生长、发育所需的mRNA、rRNA、tRNA、各种酶类和蛋白质、卵磷酯蛋白和糖元等物质从何而来呢？原来，在卵子发生期间，母体效应基因起着十分关键的作用，通过它们的转录和表达，在卵母细胞中积累、储藏了大量所需的各种物质，为启动早期发育做了充分的准备。这种发育前的准备在所有动物中普遍存在，但具体的方式和途径各有不同。,灯刷染色体与RNA转录在某些动物卵子发生过程中，常可观察到卵母细胞内的染色体状似灯刷，故名灯刷染色体(lampbrush Chromosome)。在地中海伞藻(Acetabularia metiterranea)也可观察到这一典型的结构，而在果蝇、玉米等配子发生过程中则可看到非典型灯刷染色体的存在。,灯刷染色体是双线期同源染色体开始分离的二价体，每个二价体由4条染色单体组成，之间可见染色体交叉现象。每一染色体由轴和侧环组成，两个相近大小的侧环从轴伸出，轴上有大小不等的染色粒，由浓缩的染色质构成。一个侧环平均约含100kb DNA，每个环共有4个拷贝。蝾螈每组染色单体约含5000个侧环，每个卵母细胞核内共有侧环约20000个(50004)。,研究表明，灯刷染色体的侧环为去螺旋化的DNA双链，是RNA活跃转录的部位。每个侧环多为一个大的转录单元，但也有的侧环包含几个转录单元。转录本的3端由RNA聚合酶固定在侧环上，5端游离侧环并与蛋白质结合成核糖核蛋白复合物(RNP)。合成后的RNP进入细胞质，使卵母细胞储备大量各种所需的mRNA及其RNP，为受精后启动早期胚胎发育作好准备。,核仁扩增与rRNAs储备为了满足早期胚胎快速发育的需要，必须在短期内合成大量的多种蛋白质。因此，不仅要提供大量的多种多样的mRNA，还要有大量作为蛋白合成工厂的核糖体存在，包括大量rRNAs。由于合子基因组在发育早期是不活动的，蛋白质的合成完全依赖于母体效应基因储存在卵子细胞质内的转录和表达产物。下面我们来看看rRNAs在卵母细胞内是如何进行高效合成的。,真核生物共有4种rDNA,分别编码18S、5.8S、28S和5S rRNA。前3种依序相连在一起共同组成一个转录单元。因物种不同，每个基因组中有100-5000个这种转录单元的重复序列，它们串联重复簇聚在单条染色体或少数几条染色体上，构成单个或数个核仁组织者(nucleolar organizer,NOR)，参与间期核仁的形成。人的基因组中有200个rDNA转录单元，串联重复簇聚在5条不同的染色体上；爪蟾每个基因组中有450个重复单元，簇聚于1条染色体上。这些rDNA由RNA聚合酶专一进行转录，然后转录本被剪接加工为18、5.8和28S rRNAs。,5S rRNA(120bp)的基因不定位于核仁组织者内，其拷贝多达数千(人约为20004)至数万(爪蟾约为240004)，它们同样以串联重复的方式簇聚排列在其它染色体上。5S rDNA由RNA聚合酶III转录。尽管在卵母细胞中存在如此众多的包含3种rDNAs(18S、5.8S和28S)重复序列，但所合成的rRNAs仍难以满足早期胚胎发育的需要，某些生物如软体动物、昆虫、鱼类和两栖类还必须通过额外的rDNA扩增(rDNA amplification),为rRNAs的大量合成提供更多的模板。,滋养细胞与母体效应基因的活动 昆虫的卵母细胞内同样储备了大量物质供早期胚胎发育之需，但与上述情况不同的是，这些物质主要不是卵母细胞自主合成的，而是由滋养细胞(Nurse cells)代劳完成，然后储藏到卵母细胞中。因此，这些动物的卵母细胞内不出现灯刷染色体，也没有核仁扩增现象。果蝇的研究表明，滋养细胞的基因组扩增了500-1000倍，由这些多倍体细胞来保证所需物质的高效合成。果蝇的卵原细胞位于卵巢管中，每个卵原细胞连续进行4次有丝分裂共产生16个子细胞，只有中间的两个子细胞各与4个相邻姊妹细胞相联系。这两个细胞中的一个便成为卵母细胞，其它15个细胞则多倍化后成为滋养细胞。,滋养细胞合成大量RNAs和蛋白质，通过特殊的通道输送、储藏在卵母细胞内，其胞体不断增大。这些产物中包括bicoid,nanos,oskar等基因转录的mRNAs,bicoid mRNA位于卵子的前极，nanos,oskar等的mRNAs位于后极，受精后表达形成由前到后或由后到前的成形素(Morphogens)浓度梯度，以决定头胸部与腹部前后轴的极性。所谓成形素，特指某些可溶的能够扩散的物质，它们以其分布的浓度梯度特化受影响细胞的分化途径。,此外，围绕卵母细胞的滤泡细胞(Follicle cells)也会合成其它RNA及卵磷脂蛋白等物质储存在卵母细胞内，供发育之需。从上述讨论可知，一个新生命的诞生与成长，实际上早在受精之前的卵母细胞以至卵子中，通过母体基因组的活动与表达，储备了早期发育的各种必需物质，作了充分的准备。参与后代发育的这些母体基因组的基因称为母体效应基因(Maternal effect genes)。,2.3 亲缘印迹,除了上述母体效应基因为子代发育所做的各种物质储备外，近年在哺乳动物中还发现来自父亲和母亲的两个基因组版本对子代发育的贡献各不相同，且缺一不可，即是说正常的发育同时需要两个来源不同的基因组版本。这种同一遗传结构因来源不同(父源或母源)而表现出功能差异的现象称亲缘印迹(Parental imprinting)或基因组印迹(Genomic imprinting)。因基因组版本的改写发生于配子发生阶段，故将这一问题安排在本章讨论。,亲缘印迹的机理精子和卵子所携带的基因组版本是在配子发生时改写的，分别打上了父亲或母亲的印迹，因而两种版本具有不尽相同的功能。那么，这种亲缘印迹的实质是什么呢？研究表明，它与DNA尤其是基因的启动子及增强子的甲基化程度存在密切的关系。在真核生物中，当胞嘧啶与鸟嘌呤处在DNA链上相邻的位置时，胞嘧啶往往被甲基转移酶识别并加上一个甲基基团后成为5-甲基胞嘧啶,如C*pG 或 GpC*。除了CpG外，CpT,CpA,CpC中的C也存在甲基化的现象。,DNA合成时，该甲基化模式可以通过甲基转移酶予以复制，使两个子细胞获得相同甲基化的遗传组成。在哺乳动物中，大约70%的CpG或GpC序列中的C被甲基化。一般而言，基因的甲基化程度与该基因的转录活性成反比。,在哺乳动物配子发生过程中，C*多被去甲基化还原为C，然后再按自身的性别重新进行甲基化。精子DNA的甲基化程度高于卵子，即使受精后各自仍保持原样，导致父源和母源基因组版本的转录活性出现差异。因此，父源基因组和母源基因组对后代性状的程序性控制并不总是一样的。因甲基化修饰程度不同所产生的功能性差异在胚外结构(滋养层、胎盘)和胚胎本体的发育中使两个基因组版本发生了分工，亦使同一遗传结构的缺陷因来源不同而表现出临床症状的差异。,