《核酸理化性质》PPT课件.ppt
第3节 核酸的理化性质,一 物理性质,DNA为白色纤维状固体;RNA为白色粉末状固体?,1、形态,2、溶解性,微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小。,核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。,核酸的理化性质,3、两性解离,由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低，整个分子相当于多元酸。,利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。,嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来测定核酸的含量。,纯的DNA：A260/A280=1.8 纯的RNA：A260/A280=2.0,二 紫外吸收性质,A260/A280值可以反映核酸的纯度。,核酸的理化性质,核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。,三 核酸的变性,核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫变性。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。,1.增色效应,核酸的理化性质,DNA分子变性(DNA denaturation),D.S.DNA,S.S.DNA,(加温,极端pH,尿素,酰胺),变性过程的表现,S.S.DNA粘度降低,S.S.DNA 沉降速度加快,S.S.DNA分子的A 260 nm UV 值上升(Hyperchromicity),热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。,2.熔解温度,核酸的理化性质,三 核酸的变性,热变性曲线(熔解曲线),图5-26 Tm的示意图,在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。,核酸的理化性质,1.185,Concentration 50 g/mL,D.S DNA A260=1,S.S DNA A260=1.37,dNTPs A260=1.60,Tm,=OD增加值的中点温度(一般为85-95),Tm值与DNA的均一性、G-C含量、介质离子强度、pH等因素有关。,核酸的理化性质,三 核酸的变性,Marmur-Doty Formula,Evaluation GC%of DNA,Tm1 Tm2,what is meaning?,Tm=69.3+0.41 GC%,l 增色效应的跳跃现象(Jump of Hyperchromicity),高分子量的DNA分子在热变性过程中,富含AT区域首先发生 变性,然后逐步扩展,表现增色效应的跳跃现象,使变形过程加快.,影响 Tm值的因素,在 A,T,C,G 随机分布的情况下,GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外）,碱基堆积面 和 碱基积压程度的差异,例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含AT的变性 核心区（promoter,terminator region）常表现氢键的断裂与形成的“DNA呼吸现象”,37.6 57,Tm,碱基排列对Tm值具有明显影响,大片段D.S DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小,但与组成和排列相关,小于100bp 的 D.S DNA分子比较,片段愈短，变性愈快，Tm值愈小,变性液中含有尿素，酰胺等,盐浓度的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,Na+在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,Tm,Tm,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH3+(质子化),改变氢键的形成与结合力,极端pH条件的影响,一切减弱氢键，碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低,四 核酸的复性,1.复性(renaturation),DNA水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一样的双股螺旋过程。,复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在一定的盐浓度下缓慢降温。,核酸的理化性质,DNA 分子的复性(anneal or renaturation),D.S DNA,S.S DNA,Denaturation,Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞(Depends on the collision of complementary S.S.DNA),2.减色效应(hypochromic effect),当变性的DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值则减小，这种现象称为减色效应。,核酸的理化性质,四 核酸的复性,影响DNA复性过程的因素：,S.S,DNA 的初始浓度 C0,DNA 分子中,dNt 的排列状况(随机排列,重复排列),复性发生的过程讨论,遵循second order kinetics formula（二级反应动力学）,dCt/dt=-KCt2,两条部分同源的S.S.DNA,在复性过程中形成的部分 双链区是不稳定的,单链DNA的随机碰撞 过程（randomly collision）,dCt/dt=-KCt2 积分,Ct/C0=1/1+KC0t,当 Ct/C0=1/2 时,Ct/C0=1/2=1/1+KC0t(1/2),K=1/Cot(1/2),Cot(1/2)=1/K(mol.Sec/L),不同的DNA Cot 是不同的，Cot 不但与K值有关，也与DNA的复杂性有关；K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及DNA分子复杂性；如果将其它因子固定，则K与复杂性X的关系为：K=1/X,所以，Cot=1/K=X：,Cot(1/2)=1/K(mol.Sec/L),复杂性(X)-DNA中没有重复碱基的排列顺序的数值。e.g.(A)n,X=1;(AT)n,X=2;(AGC)n,X=3;(AGCT)n,X=4;(AGCTG)n,X=5;Cot 代表DNA顺序的复杂程度。,Cot(1/2)=1/K(mol.Sec/L),3.分子杂交(hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,不同来源的单链DNA与单链DNA RNA与 单链DNA分子间 在长于20 bp的同源区域内 以氢键连接方式互补配对 形成稳定的双链结构的过程,3.分子杂交(hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,DNA链在复性时，其中的一条单链可以内异体DNA单链，按照碱基互补原则合成一段DNA-DNA或DNA-RNA双链的过程。,3.分子杂交(hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,杂交检测,D.S.DNA,X-film,Column absorb D.S DNA,p32 or biotinlabeled,S.S.DNA(as probe),S.S.DNA,种类,液相分子杂交,Absorb D.S.DNA,1975 E.M.Southern,1977.J.C.Alwine,1978.Hany Towbin,原位分子杂交(In situ hybridization),Southern blot,Northern blot,Western blot,S.S.DNA S.S.DNA,S.S.RNA S.S.DNA,Protein antibody,五 DNA 一 级 结 构 分 析（DNA sequencing）,1972.Herbert Boyer 限制性核酸内切酶II(RE-II),Sanger C.“,”法,Maxam Gilbert 化学定序法,Sanger C.ddNTP(酶)法,1.历史,(1)Chemical sequencing,G系统；pH 8.0 硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂 脱G,A+G系统；pH 2.0 哌啶甲酸（pidine）嘌呤环 N质子化 脱嘌呤,C系统；1.5 mol/L NaCl C+肼（hydrazine）脱C,T+C系统；肼(hydrazine)打开嘧啶环 重新5C环化脱嘧啶,2.方法,Chemical sequencing,(2)双脱氧法,4ddNTP系统中DNA链均终止在ddNTP(二脱氧核苷酸),六 DNA的甲基化（Methylation）(m5C in Eukaryote),m5C,1.DNA中m5C的特点,CH3,修饰核糖右下角：Am碱基左上角：m22,7G,举例.a.DNA m5dC 5-甲基脱氧胞苷；m6dA N6-甲基脱氧腺苷；n2dA 2-氨基脱氧腺苷。,2.甲基化的方式,b.RNA m1A 1-甲基腺苷 m6A N6-甲基腺苷 m26A N6,N6-二甲基腺苷 m6AmN6,2-O-二甲基腺苷,3 Function of m5C,细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分化与m5C的相关性（5-氨胞苷去甲基化的作用）,m5C-甲基化是生物自我保护的机制,m5C-使Z-DNA在体内趋于稳定状态,m5C 与基因突变的关系,C m5C T gene mutation(癌变),CH3,O,氧化脱氨,本章结束,
