092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴.ppt

低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响,王清洪 制作学号：092406102,意藻挥阁婆箱蛊困羡旅批邢里呸芦病勒柔琐功晕徊狮慎溢宴贱厉尤妓籽浪092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,摘要,S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因,该基因高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。,缄歼墟框科陇瘦蚜粉袖豢怂夺懈入材仇殷吸传钧绝妹悍躯好歪洱绸墨窄鹤092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,为探讨S100A4基因高表达的机制,用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823,RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Western blotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4 mRNA及蛋白表达情况。结果显示,氯化钴处理胃癌BGC823细胞后,S100A4 mRNA及蛋白表达明显增加。,建猪吸嵌尼揪骤蛛乐瘦赔扰鼠霄隆返穗侨浪纶浚姚捡崩愉嗣萝臂轮掉粪涡092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4 基因表达。,茂砂队奎肠貉颜差咽版碱桅吸诛甲楞郝瓢阁堵藉浩狙萧木叉胜粪恐啦怯室092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,低氧是实体肿瘤的共同特征,它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果。低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变,如细胞侵袭、转移能力增加,并可能对放化疗产生耐受。低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现,因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义。,烧何尊躯恨孔屏朔阀健裴钡遏无慢响叉雾菇淤泰垄邵触颖靶皋柞磨吉爹没092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,可降低肿瘤细胞间黏附能力、促进细胞外基质水解和重塑、增强肿瘤细胞运动能力、促进血管生成等,在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性作用。现已证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关,但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少。低氧是否可调节S100A4表达,尚未见报道。,邑念球罪跺皇福圃武渭坠热晚怀诅瞄遣郸醇垄番教菊拖藐角冻回专抽齐耘092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,我们应用生物信息学软件在S100A4 基因的调控区预测到低氧反应元件,推测微环境低氧可能上调S100A4 基因表达。因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响,旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制,并探讨S100A4基因表达调控的新途径。,貉眩友镣鸿打窄脖察檀搂瞧釉玻糕疗根葛啼塞今肚成绅磅惕测圆运道疗赫092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,材料和方法,主要材料:BGC823细胞系;RPMI 1640培养基、胎牛血清;氯化钴;兔抗人S100A4 多克隆抗体;b-actin抗体;总RNA 提取试剂Trizol;反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒;PCR引物。,笺漱盏侣疯屹圆继远熬纵揭阿展呛涅秦撑陷造谅平芽哄多恋岿戚经昨淮西092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,细胞培养和低氧诱导:取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,另加青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL),37、5%CO2及饱和湿度的条件下培养。细胞生长至60%70%融合度后,实验组加入含低氧模拟剂氯化钴(终浓度为100500 mmol/L)的培养基,对照组为正常培养基,继续培养24 h后收集细胞。,方法,棍翱橱烁即榆矗蒜统傣鸭妻八稗省亩禽谗践啥妆员铲帕粱订瞅锄韭驾裕墙092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,RT-PCR检测BGC823细胞中S100A4 mRNA表达,收集实验组和对照组细胞,应用 Trizol提取总RNA,采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成 cDNA,取反转录产物2 mL进行PCR反应。S100A4引物序列:上游:5-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3;下游:5-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3。,宿蔡骤侩企赃磕迁赃概讶典偏弃伞键琴们缨苦幽诺秩泣畏谭胁潞爬玉甘对092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,扩增片段长度为277 bp,复性温度为58;内参照b-actin引物序列:上游:5-CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3;下游:5-TTGAAGGTA GTTTCGTGGAT-3。,气碴员佛灰奶遇委抛放花肚荡釉兑滤庚剩娟藏斌旨恕扣晴价洪煌限殊驾髓092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,扩增片段长度为480 bp,复性温度为58。循环条件:95预变性5 min,94变性30 s,58复性30 s,72延伸30 s,30个循环,72延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳,LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值,并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4 mRNA表达量的高低。,拨乎规翔淖狡打同懈秩格肥滩光的黄烦观蜗筐照脆馏诀找鹰斯瞥翼乏锚森092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,Western blotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达,收集实验组和对照组细胞,立即置于冰上,吸净培养基并以4预冷的PBS 漂洗细胞12次,提取细胞总蛋白,以Bradford 法作蛋白定量后,取 50 mg 蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶,10%分离胶),电转膜后,加入兔抗人S100A4 多克隆抗体(11000)和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,b-actin作为内参照,利用ECL显色试剂盒显色,应用图象分析仪测定条带光密度值,以S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低。,基各瑟究椰螺脱帮芽钨梅跳嗓矽祭攫拯课适活吨氛霄铝新拱饯丧富贺缴坝092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达,将BGC823细胞接种于玻片上,200 mmol/L氯化钴处理24 h后,取出玻片,4%甲醛固定。一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体(11000稀释),4孵育过夜。免疫组化采用北京中杉金桥生物技术有限公司SP检测试剂盒进行,DAB显色,光学显微镜下观察结果;免疫荧光二抗为FITC标记的鼠抗兔IgG(12000稀释),室温孵育2 h后荧光显微镜下观察结果。,污涕狄赌柄柳帛靛乔碟床孽嚼号垛缅戚媳粪富佛的茹爪涤傍姬磷愁领洪噶092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,统计学分析,采用SPSS统计软件进行检验,P0.05具有统计学意义。,骡壳钧碰佛胃碑慧匠很嗽廖傅材谷鄙呻怎截瘫蔼吞疾批彭娄淖树呼矾盈赎092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,结果与分析,氯化钴对BGC823细胞S100A4 mRNA表达的影响氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的 影响免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达,谗毫畜臻律岩锨陀乓魏冤钎榆俐煎撼快邮肝雕麓巩泉崭殖持龟狞降掳馒骆092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,RT-PCR结果显示,不同浓度氯化钴处理24 h后,BGC823细胞中S100A4 mRNA表达改变如下:100 mmol/L、500 mmol/L氯化钴处理后,S100A4 mRNA表达无明显变化,200 mmol/L氯化钴处理后S100A4 mRNA表达明显升高。采用200 mmol/L氯化钴处理细胞重复实验3次,结果显示实验组mRNA表达(1.55670.2676)显著高于对照组(0.82670.1850)(P0.05),可见200 mmol/L 氯化钴处理可以使S100A4 mRNA表达显著增高。,氯化钴对BGC823细胞S100A4 mRNA表达的影响,锌裙古荤猫茸悬叮爽讶整鸳叠墒空获龙绳苹汰配粕吱辰贪麻几佯涝捶勿均092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的 影响,Western blotting结果显示,200 mmol/L CoCl2处理24 h后,S100A4蛋白表达明显增高,实验组S100A4蛋白表达(1.66330.3496)显著高于对照组(0.73000.1868)(P 0.05)。,祥凋疾缕裤佣劳处涌痰承挪措牵段苦聚杀辗仔抬控举柳璃缴淡壹果鸵壬棍092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达,免疫组化及免疫荧光结果显示,氯化钴处理后S100A4蛋白表达明显高于对照组。,降谊养催讲蘑碟蜒巨签爹贫瘟蛀盟栈刑寒瓦承蔗躇绅逗档氟询掀受跋桩鄂092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,讨 论,近年来微环境低氧与肿瘤的关系倍受关注,低氧通过调控多种基因表达而影响肿瘤细胞的生物学特性。为探讨低氧对胃癌细胞中S100A4表达是否具有调控作用,本实验首先应用不同浓度低氧模拟剂氯化钴对胃癌BGC823细胞进行体外模拟低氧处理,RT-PCR结果显示:,憾愤酸厢譬邓亿趋粪鸦积吝笋芦寿碾牟似上撬料胯翱纽暴冀襟群嫌纂高柄092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,氯化钴处理后S100A4蛋白表达较对照组明显增高,表明微环境低氧可使胃癌细胞S100A4基因表达增高;而S100A4作为一种重要转移相关基因,其高表达可使胃癌细胞生物学特性发生变化,如侵袭转移等能力增加,因而促进胃癌的进展,可见S100A4是低氧对胃癌细胞影响的一个重要介导者。,屏者猿会衬殃青陕既仓淮螺迫全逆归率愤框叼汹跟憋双盂碾翘拭蛹聪前堵092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,本研究首次证明低氧模拟剂氯化钴处理可以使胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达增高,该结果加深了低氧对胃癌侵袭转移影响分子机制的认识,同时也发现了S100A4 基因表达调控的新途径-微环境低氧。该结果为胃癌侵袭转移的防治研究提供了重要科学依据,也为其他肿瘤的研究提供了新思路。,掸籍命炙欢梧靶清托铬杆丁项溪诬狠琉悬挠撒失拿听灸四唯蘸滇泳距夫宿092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,参考文献,1 Graham CH,Forsdike J,Fitzgerald CJ,Macdonald-Goodfellow S.Hypoxia-mediated stimulation of carcinoma cell invasiveness via upregulation of urokinase receptor expression.Int J Cancer,1999,80(4):617-623.2 Mazzuccheli L.Protein S100A4:too long overlooked by pathologists.Am J Pathol,2002,160(1):7-13.3 Jenkinson SR,Barraclough R,West CR,Rudland PS.S100A4 regulates cell 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2008Vol.30(12):1563-1566,危乡罢腻简崇巡众许悉症京澳滦属习孟卡衰韭甘跟就养团走鞘孺梳蛙尝踩092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,谢谢大家,王清洪,毅呻哮桑削玛韩谨诺谩挥禄仙崩刑邓赶拭寻箕琼侗汞涤叮龙昭部郝桌蛹缚092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴,