分子遗传学重点讲义资料.doc

绪论1. 分子遗传学:是研究遗传信息大分子的结构和功能的科学。它依据物理、化学的原理来解释生命遗传现象，并在分子水平上研究遗传机制及遗传物质对代谢过程的调控。2.Ø 分子遗传学研究对象：从基因到表型的一切细胞内与遗变异有关的分子事件。不仅仅包括中心法则中从DNA到蛋白质的过程。Ø 分子遗传学研究内容：遗传信息大分子在生命系统中的储存、复制、表达及调控过程。Ø 分子遗传学研究目标：明确遗传信息大分子对生物表型形成的作用机制。第二章 基因1. 从遗传学史的角度看，基因概念大致分以下几个阶段：泛基因（或前基因）孟德尔（遗传因子）摩尔根（基因）：基因是功能单位（决定性状），基因是突变单位（基因是突变的最小结构），交换单位(交换的最小结构)三位一体的组合。顺反子：在一个等位基因内部发生两个以上位点的突变，如两个突变位点位于同一染色体上，为顺式结构，生物个体表现为野生型；突变位点分别位于两个同源染色体上，为反式结构，生物个体表现为突变型。即其顺式和反式结构的表型效应是不同的。一个具有顺反效应的DNA片段就是一个顺反子，代表一个基因。（或者具有顺反效应的DNA片段就是一个基因）（基因内部这些不同位点之间还可以发生交换和重组：一个基因不是一个突变单位，也不是一个重组单位）操纵子：基因是一个转录单位，是一个以不同来源的外显子为构件的嵌合体,处于沉默的DNA介质（内含子）中现代基因2.鉴定基因的5个标准1）基因具有开放性阅读框ORF。2）基因往往具有一定的序列特征。3）基因序列具有一定的保守特性。4）基因能够进行转录。5）通过基因失活产生的功能改变鉴定基因。（能排除假基因的干扰）3.蛋白质基因：能够自我复制的蛋白质病毒因子。朊病毒：一类不含核酸而仅由蛋白质构成的可自我复制并具有感染性的因子。4. 基因组印记(genomic imprinting)：由于一些可遗传的修饰作用（如DNA、组蛋白甲基化作用）控制着亲本中某个单一的等位印记基因活性，从而导致个体在发育上的功能差异，使个体具有不同的性状特征。5.印记基因（imprinted gene）：表达特性取决于它们是在父源染色体上还是在母源染色体上的等位基因。6. 组蛋白上的共价键修饰：包括甲基化、乙酰化、磷酸化等在组蛋白上以组合形式。这些修饰的组合能改变染色质的结构，进而影响基因的表达。属于一种表观遗传学现象(epigenetics )。7.组蛋白密码含义：1）组蛋白末端不同的修饰作用将诱导与染色质相连蛋白之间的相互亲和力。2）一个核小体中同一末端的修饰可能是相互依赖的，产生不同组合。3）染色质高级结构的不同性质极大地依赖于具有不同修饰的核小体共价修饰的局部浓度和组合。8.新基因的产生和进化：途径：1）基因突变；2）基因重复：冗余基因（单基因重复，部分、完整基因组重复）；3）转座：简单转座、复杂转座；4）水平转移：不同物种之间（转化、转导、结合）5）RNA选择性剪切、编辑9基因分类：1）按照基因在细胞内分布的部位，可将其分为细胞核基因和细胞质基因。2）按照基因的功能，可将其分为结构基因、调节基因和操纵基因。结构基因：编码蛋白质或RNA的，具有一定生理功能的基因。调节基因：某些可调节控制结构基因表达的基因，调控基因突变可以影响一个或多个结构基因的功能，导致一个或多个蛋白质(酶)合成量的改变。操纵基因：与一个或者一组结构基因相邻近，并且能够与一些特异的阻遏蛋白相互作用，从而控制邻近的结构基因表达的基因。 3）按照基因形态分 ：断裂基因（真核）：基因的编码序列在DNA放在上不是连续的，而是被不编码的序列隔开，形成镶嵌排列的断裂形式。重叠基因（原核）：指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。功能：经济和有效地利用DNA遗传信息量。重叠基因中不仅有编码序列也有调控序列，可能参与对基因的调控。跳跃基因（转座子）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。原核生物转座子的类型：简单转座子（插入序列：insertional sequence,IS)复合转座子(composite transposon)TnA家族 转座子转座机制转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的。（IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列）。转座的方式：反转录转座 切离转座 复制转座转座作用的遗传学效应转座引起插入突变；转座产生新的基因；转座产生的染色体畸变；转座引起的生物进化。4）按照是否转录或翻译来分可转录但不翻译 (tDNA, rDNA 可转录、可翻译的（乳糖操纵子结构基因 Z,Y,A ;大多数功能基因。) 不转录、不翻译 (promoter, operator ) 10. 基因组（genome）：生物中，一个物种单倍体的染色体所携带的一整套基因。11. 原核生物基因组的特点：1）原核生物的基因组很小，DNA含量低；2）原核生物DNA不和蛋白质固定结合，一般不具有核小体结构；3）原核生物的基因组内绝大部分序列用于编码蛋白质。4）功能上密切相关得到基因高度集中形成一个功能转录单位，可以转录形成含有多个蛋白质分子的一个mRNA单元。5）重复序列少，具重叠基因。12. 真核生物基因组的特点：1）真核生物基因组的分子量大；2）真核生物的DNA一般与蛋白质结合成染色体；3）转录和翻译在细胞中不同的位置进行。4）基因组DNA的大量序列不编码蛋白。5）真核生物的蛋白编码基因往往以单拷贝存在。6）真核生物的蛋白编码基因大部分为断裂基因。13. 真核生物基因组DNA序列的分类1）基因序列和非基因序列 基因序列指基因组里决定蛋白质(或RNA产物)的DNA序列。非基因序列则是基因组中除基因以外的所有DNA序列，主要是两个基因之间的间插 序列(intervening sequence)。2）编码序列(Coding sequence)和(Non-coding sequence)非编码序列 编码序列指编码RNA和蛋白质的DNA序列。非编码序列指基因的内含子序列以及居间序列的总和。3）单一（单拷贝）序列(single copy sequences)和重复序列 (repetitive sequences)单一序列是基因组里只出现一次的DNA序列，又称非重复序列。4）单一基因和基因家族14. 重复序列：在基因组中重复出现的DNA序列。1）中度重复序列：重复次数为几十次到几千次。如rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白质（如组蛋白、肌动蛋白、角蛋白等）的基因。2）高度重复序列：重复几百万次，一般是少于10个核苷酸残基组成的短片段。如异染色质上的卫星DNA。15.基因家族（gene family）：真核生物基因组中来源相同，结构和功能相关的一组基因形成一个基因家族。16. 多基因家族 (multigene family) ：多基因家族是一个基因组中功能相似、进化上同源的一组基因。17. 超基因家族（supergene family）：DNA序列相似，但功能不一定相关的若干基因家族或单拷贝基因总称。由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同。18. “C值悖论”与”N值悖论”生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值低等生物中，随着生物进化，增加了生物体的结构和功能的复杂性，基因组也相应地增大即C值。随着进一步的进化，在其他生物中则看不到这种规律。 生物基因组的大小(C-value)同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(Cvalue paradox)。生物中包含基因的总数目，称为N值 . 生物基因数目(N-value)同生物进化程度或生物复杂性的不对应现象，称为N值悖理(Nvalue paradox)。第三章 染色质1、染色质的分子构成：DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA2、DNA的结构层次：1）、一级结构2）、二级结构3）、三级结构：DNA的三级结构是指DNA中单链与双链、双链之间的相互作用形成的三链或四链结构。如H-DNA或R-环等三级结构。4）、超级结构3、染色体四级结构模型： 核小体+连接丝 螺线体(solenoid) 超螺线体(super-solenoid) 染色体(Chromoson)4、DNA变性：在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性5、变性后特征： 增色效应；旋光性下降；粘度降低；生物学功能丧失或改变。 6、Tm值：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的变性温度（82-95）。（1）DNA的均一性：均质DNA的Tm范围较小，异质DNA的Tm范围较大；（2）G-C的含量：G+C的含量越高，则Tm越高。Tm69.3+0.41( GC)；（3）介质中的离子强度：离子强度高，Tm较高，且Tm范围较小。7、DNA复性： 变性DNA在适当条件下，又可以使两条彼此分开的链重新缔合（reassociation）成为双螺旋结构，这过程称为DNA的复性(renaturation)。 复性速率公式： C/C0 = 1/(1+kC0t)C: t时单链DNA的浓度; k:反应常数; C0: t0 时DNA的初始浓度。C/C0=1/2时， 即复性反应完成一半时C0t 值定义为Cot1/2。C0t 1/2= 1/kC0t ½的大小与DNA的分子量及复杂度有关复杂度：DNA分子中无重复核苷酸序列的最大长度。（1）C0t ½越大，表示复性速度 越慢，DNA的分子量越大。 （2）在不存在重复序列的情况下, C0t ½值与基因组的大小成正比,也即与 反应体系中的复杂度成正比。 （3）在有重复顺序的复性中,在同一个复性曲线上的各动力学组分的C0t ½并不因基因组的大小而增减,而是与DNA序列的重复频率成反比。 8、RNA主要有3类，即信使RNA（mRNA），核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）。 常染色质（伸展染色质、功能性染色质）染色浅，螺旋化程度低呈松散状、有转录功能、单一顺序DNA。9、染色质的分类 异染色质（浓缩染色质、非功能性染色质）螺旋化程度高呈凝集状、染色深、功能上不活跃、含重复顺序DNA、复制时间晚。包括组成型异染色质和兼性异染色质10、组蛋白：真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，富含精氨酸和赖氨酸等碱性。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。分为5种类型(H1，H2A，H2B，H3，H4)，后4种各2个形成组蛋白八聚体，构成核小体的核心，占核小体质量的一半。 11、核小体：组成真核细胞染色体的基本结构单位，由组蛋白和大约200个bp的DNA组成的直径约10 nm的球形小体。其中大约146 bp的DNA区段与八聚体(H2A、H2B、H3和H4各两分子)的组蛋白组成核小体的核心颗粒，核心颗粒间通过一个组蛋白H1的连接区DNA彼此相连。Kornberg 模型；Jackson模型；近代模型。 12、非组蛋白：一组极不均一的在细胞内与DNA结合的组织特异蛋白质（15100 kDa）。大多为酸性蛋白质，参与基因表达调控。非组蛋白包括以DNA作为底物的酶，也包括作用于组蛋白的一些酶，如组蛋白甲基化酶。此外还包括DNA结合蛋白、组蛋白结合蛋白和调节蛋白。 特点：组织特异性；调控转录；专一DNA结合。13、常染色质（Euchromatin）：间期核内染色质丝折叠压缩程度低，处于伸展状态，着色浅的那部分染色质。富含单拷贝DNA序列，有转录活性。 14、异染色质（Heterochromatin）：间期核内染色质丝折叠压缩程度高，处于凝聚状态，染料着色深的那部分染色质。富含重复DNA序列、复制延迟，一般无转录活性。 第四章1.操纵子(operon)：有原核生物中，由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位（coordinated unite），称为操纵子(operon)2.乳糖操纵子（lac operon） 调节机制：基因编码产生阻遏蛋白，阻遏蛋白为四聚体，在没有乳糖的条件下，阻遏基因与操纵基因结合。当有乳糖存在时，经透酶作用进入细胞，在-半乳糖苷酶催化下转变成半乳糖，后者作为诱导剂（inducer）与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵基因解聚，结构基因转录。乳糖操纵子的结构 大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因。基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。 阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子半乳糖苷酶、透酶生成。 当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数 -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。CAP的正性调节 分解代谢物基因激活蛋白 CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。 由此可见，对乳糖操纵子来说 CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。 对调节机制的解释 大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。 倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与 O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 3.阿拉伯糖操纵子（ara operon） 结构基因 B、A、D，分别编码异构酶（isomerase）、激酶（kinase）、表位酶（epimerase），催化阿拉伯糖转变为5-磷酸木酮糖 调控区 由启动子（P）、起始区（I）和操纵基因（O）构成调控机制：C基因是调节基因，编码调控蛋白AraC， AraC蛋白单独存在时，结合到araO1和araO2，表现出负调控；阿拉伯糖使AraC蛋白变构，结合到araI上，表现正调控。在ara操纵子基因表达调控中，CAP蛋白的调控作用不显著。葡萄糖在阿拉伯糖操纵子发挥了重要的中用：有葡萄糖时：cAMP低时：CP结合位空，一个C蛋白与araO1和araO2结合，将DNA拉成一个环，BAD启动子阻遏，C基因启动子也阻遏。无葡萄糖，有阿拉伯糖时：cAMP高时： cAMP 与CP结合，C蛋白放出araO2结合部位，DNA不形成环，激活RNA聚合酶，BAD启动子启动。调控作用： 有葡萄糖，有或无阿拉伯糖：关闭 无葡萄糖，无阿拉伯糖：关闭 无葡萄糖，有阿拉伯糖：开放4.色氨酸操纵子（trp operon）结构特点 E.coli的色氨酸操纵子有五个结构基因E、D、C、B、A基因编码三种酶，用于合成色氨酸， 上游调控区由启动子（P）和操纵基因（O）组成 R基因编码阻遏蛋白调控机制： 阻遏型机制及衰减机制。衰减子位于结构基因E和操纵基因O之间的L基因中。L基因的部分转录产物编码14个氨基酸，其中含两个相邻的色氨酸密码子，这两个相邻的色氨酸密码子及原核生物中转录和翻译的偶联是产生衰减的基础。调控作用： 将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。正调控系统Ø 调节基因的产物是激活蛋白Ø 根据激活蛋白的作用性质，又可分为可诱导的正调控和可阻遏的正调控。负调控系统Ø 调节基因的产物是阻遏蛋白。Ø 根据其作用特征又可分为可诱导的负调控和可阻遏的负调控。第五章1.多层次调控：2. 真核生物基因表达调控的特点：1)在真核生物中，染色体的结构对基因的表达有明显的调控作用；2)真核基因的转录和翻译是在不同地点不同时间进行，从而使真核基因的表达有多种转录后的调控机制； 基因表达具有时间性和空间性。 时间性：个体发育的不同阶段，基因表达的种类和数量是不同的； 空间性：在不同组织和器官中，基因表达的种类和数量是不同的。3)真核生物基因表达存在细胞特异性或组织特异性。4)真核生物的基因表达调控是多因子、多步骤的调控过程。3. DNA水平的调控: 基因丢失 在细胞分化过程中，某些原生动物、线虫、昆虫等体细胞通过丢失某些基因而除去这些基因的活性。 基因扩增某个或某些基因的拷贝数选择性增加的现象。这种增加可以发生在细胞或组织内，也可以在体外(试管中)或在细胞或组织中。这种增加一般与基因组的其他基因的增加不成比例。（爪蟾卵母细胞成熟中rDNA的扩增。） 基因重排 指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。（免疫球蛋白IgG ）4.转录水平的调控1)顺式作用元件:指DNA上对基因表达有调节活性的某些特定的调节序列，其活性仅影响与其自身处于同一DNA分子的基因。这种DNA序列多位与基因旁侧或内含子中，不编码蛋白质。启动子：位于转录起始位点附近，具有相对固定位置，且为转录起始所必需的序列元件。核心启动子，TATA box上游启动子成分（UPE），CAAT box等TATA框控制转录的精确性，而UPE则控制转录的起始频率，启动子的强度决定于UPE的数目和种类。增强子：位于转录起始位点较远位置上，具有参与、激活和增强转录起始功能的序列元件。增强子元件常常是组织特异性或短暂调节的靶位点。特点：与启动子相对位置和取向无关，只要存在于同一DNA分子上都能起作用；没有基因专一性，可以在不同的基因组合中表现增强效应；严格的组织特异性和细胞特异性；作用机理：（1）为转录因子提供进入启动子区的位点（2）改变染色体的构像绝缘子：能阻断激活或失活效应通过的元件特征： 当绝缘子位于增强子和启动子之间的时候，它能阻断增强子对启动子的激活作用 当绝缘子位于活性基因和异染色质之间时，能保护活性基因免受异染色质延伸所带来的失活效应 绝缘子的作用是增强基因调控的准确性应答元件：一组受共同调控的基因，各基因都有一个相同的序列元件，该元件是诱导型转录因子（inducible activator ）识别靶基因的位点特点： 是启动子的上游元件（如HSE）或增强子（如GRE） 都含有短的共有序列，但不一定完全相同 转录因子结合区在共有序列的任一侧附近2）反式作用因子(trans-acting factor)：指能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件815bp核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质，也称序列特异性DNA结合蛋白(sequence specific DNA binding protein，SDBP)，这是一类细胞核内蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域。三个功能结构域：DNA结合域： 锌指结构（Zinc finger motif） 同源结构域（Homodomain） 亮氨酸拉链（Leucine zipper） 螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix structure) 螺旋-转角-螺旋(Helix-turn-helix) 转录活性域：反式作用因子并非都需要其直接与DNA结合，转录活化域是反式作用因子必须具备的结构基础。转录活化域通常是依赖于DNA结合结构域以外的30100个氨基酸残基。转录因子通常具有一个以上的转录活化区。结合其它蛋白结构域：反式作用因子根据作用方式分为三类： 通用转录因子。普遍存在的转录因子。如TATA box结合因子 TFD、GC box结合因子SP1 等。组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性有很大关系。诱导性反式作用因子。活性能被特异的诱导因子所诱导。3）转录起始调控：反式作用因子的活性调节 表达式调节 合成后即有活性，不能积累 共价修饰 磷酸化、去磷酸化，糖基化 配体结合 激素受体 蛋白质与蛋白质相互作用 复合物的解离与形成反式作用因子的作用方式 成环 使相应位点接近而发挥作用 扭曲 改变DNA构型 滑动 沿DNA滑动到另一特异序列而发挥作用 连锁反应（Oozing） 转录因子与DNA结合后促进与另一转录因子的结合真核基因的调控模型：原始模型、改进模型（多重调节基因、多重受体基因）4）转录后水平的调控：5端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后，在5端加上7甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)意义:能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭RNA 5末端，以保护mRNA免疫5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。 有助于mRNA越过核膜，进入胞质。 3端加尾:转录后在mRNA在3末端加上50200个腺苷酸，即poly(A)尾（成熟mRNA）。意义：可能有助mRNA从核到细胞质转运；避免在细胞中受到核酶降解，增强mRNA的稳定性。5端加帽(cap)和3端多聚腺苷酸化(polyA)的调控意义：Ø 使mRNA稳定，在转录过程中不被降解Ø mRNA的选择性剪切(alternative splicing)对基因表达的调控外显子选择(optional exon)、内含子选择(optional intron)、互斥外显子、内部剪接位点Ø mRNA 运输的控制mRNA前体的剪接：真核细胞基因表达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的mRNA，这一过程即为剪接。生物体内内含子的主要类型：GU-AG、AU-AC、类内含子、类内含子mRNA的选择性剪接：高等真核细胞中,某个内含子5的供点在特定条件下可与另一个内含子3受点进行剪接，同时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含子，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。 Exon，Intron是否出现在成熟mRNA是可以选择。RNA的编辑：是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。5）翻译水平的调控：翻译过程和翻译后水平的调控主要表现在翻译的起始、延长、蛋白质的加工修饰及定位等方面。 Ø mRNA运输控制Ø mRNA稳定性调节Ø mRNA结构调控Ø 翻译起始的调控6）翻译后水平的调控 新生肽链的水解 肽链中氨基酸残基的修饰 通过信号肽分拣、运输、定位 第六章RNA遗传1、RNA 世界：在产生现代生命所具有的遗传物质DNA、RNA和Protein 之前，生命是以RNA为基础发展进化而来的。RNA既是遗传物质（DNA），也有催化作用（Protein ）。RNA能够催化RNA复制中的多聚化。2、RNA干涉（RNA interference）：一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达，它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNA干涉是可遗传的。参与RNAi的各个组分：dsRNA： 双链RNA；Dicer：属于RNAaseIII家族，是双链RNA的特异性核酸内切酶。SiRNA：small interfering RNA，RNAi的效应分子。为21-23nt大小的双链RNA。RISC：RNA-inducing silencing complex，具核酸内切、外切和解旋酶活性。负责靶RNA的切割。RdRP：RNA-dependent RNA Polymerase， 是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递。RNA介导的mRNA降解：在起始步骤，加入的dsRNA被Dicer酶切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, or RISC） 激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上 并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA SiRNA 的扩增过程：siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。RNA引导的同源DNA甲基化RNA能引导同源DNA序列C的从头甲基化，可以看作是RNAi对基因组的一种反馈。该甲基化过程如同RNAi中同源mRNA的降解一样需要dsRNA的切割。形成的小RNA称为引导RNA，只有与引导RNA互补的DNA才能产生甲基化。该过程是一个RNA-DNA互作的过程。参与该过程的蛋白质：DNA重新甲基化酶（DNMT）；打开dsRNA的RNA螺旋酶。4、RNAi 的特点:、属于转录后水平的基因沉默。、干扰RNA的结构与功能之间存在相关性。2025nt 的siRNA ，它们具有 5' 末端的磷酸基， 3' 末端的羟基和 2 个突出的单链核苷酸。这种结构对于 RNAi 是十分必要的、较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。、高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。、可遗传性及远距离效应，又称RNA的可扩散性：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。、RNAi存在 ATP的依赖性。5、RNA编辑（RNA editting）：在mRNA水平上改变遗传信息的过程。RNA编辑是通过比较成熟的mRNA与相应基因的编码信息时发现的，成熟的mRNA序列中有几种意想不到的变化，包括UC，CU；U的插入或缺失、AI多个G或C的插入等。6、模糊基因：RNA编辑过的基因与其原始模板相比，在结构和功能都发生了一定的变化，因此能够进行RNA编辑的基因称为模糊基因。类型I：内部编辑的模糊基因（编码区）：CoxII 在转录本的蛋白质编码区进行编辑；类型II：5端编辑的模糊基因：Cyb,在转录本5端蛋白质编码区进行编辑；类型III：泛编辑的模糊基因（全长范围内）：CoxIII在转录本全长范围内进行编辑。（1）1、gRNA编辑模型（仅限于锥虫的RNA编辑模型）：U插入、缺失的编辑（2）高等动物中RNA编辑中AI型的编辑对基因表达的影响：ADAR:细胞核里的RNA编辑酶。移去A的氨基变成I。1)改变剪切位点2)改变编码氨基酸3)影响RNA的稳定性7、RNA编辑的特点1、RNA编辑普遍存在于各种生命遗传系统中。2、RNA编辑过程是一个真正为蛋白质编码的过程，是一个为某些蛋白质制造模板的过程。对转录本的加工幅度可大雨50%。3、RNA编辑具有系统发育的特异性，生物发育的不同事件，RNA编辑的情况也不同。其不但扩展了生物遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施。4、RNA编辑不按中心法则进行。既不是碱基序列的逐一传递，也找不到用于RNA编辑的DNA或RNA模板。第八章 1.重组DNA技术:重组DNA操作一般步骤：1）获得目的基因；直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中钓取目的基因。以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立全长cDNA文库或EST文库；从文库直接筛选所需基因。根据同源克隆等原理克隆需要的目的基因片段。直接化学合成。2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是识别并特异性地切割双链DNA序列的一种核酸内切酶。（“分子手术刀”）切割形式 ：每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。（回文结构）平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差粘性末端（sticky end）交错切载体的选择：载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体的选择标准：A能自主复制；且插入外源DNA后，不影响其复制能力；B具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；C有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；D分子量小，以容纳较大的外源DNA；E具生物安全性。外源DNA片断和载体的连接A粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接（与同种限制酶切相似）非配伍末端连接B平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端C同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。导入方式：转化 (transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。转染 (transfection)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。转染 (infection）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。4）对转化子筛选和鉴定；筛选抗药性标记选择：抗四环素标记标志补救(marker rescue)：蓝白斑筛选分子杂交法：原位杂交 Southern blot5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组DNA技术操作过程总结： 分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 2. PCR技术：聚合酶链式反应（polymerase chain eaction,PCR ）1) 原理：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段。2) 反应体系：DNA模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer3) 反应程序： 变性 ( 9495oC) 退火 延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。3基因文库：1）基因组DNA文库：将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库2）cDNA文库(cDNA library)：以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。（具有组织特异性）4.分子杂交技术分子杂交（molecular hybridization）：