动物细胞培养和核移植.ppt

动物细胞工程,动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、单克隆抗体,思考：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养、植物体细胞杂交,强调：,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,问题讨论:,烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？,取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植,一、动物细胞培养,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,1、概念：,注意关键词:细胞贴壁 接触抑制 原代培养 传代培养,阅读课文44-46面相关内容,2、过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,胚胎或幼龄动物的组织器官,细胞悬液(分散的单个细胞）,剪碎,胰蛋白酶,1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？,旁栏思考,提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。,胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,寻根问底,提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。,细胞贴壁过程,贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层,接触抑制,胚胎或幼龄动物的组织器官,细胞悬液,剪碎,胰蛋白酶,细胞贴壁接触抑制,原代培养,原代细胞,稀释、分离,传代培养,胰蛋白酶,传代细胞,原代培养,将动物组织取出来后，先用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，然后配制成细胞悬液，再放入培养瓶中初次培养的过程。,传代培养,将原代培养的细胞定期用胰蛋白酶处理，配制成细胞悬液，然后分瓶继续培养的过程。,传代10代后，细胞增殖逐渐减慢，大部分细胞衰老死亡。少数细胞存活到50代左右。1050代间，部分细胞核型可能发生变化，甚至突变为癌细胞细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，获得不死性，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系所以目前使用的细胞，通常为10代以内，以保持细胞正常二倍体核型。暂时不用可低温保存（液氮）,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,遗传物质未改变,动物细胞培养不能最终培养成生物体,探究：,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？,1、无菌、无毒,2、全部的营养物质,3、适宜的温度和PH值,4、必要的气体条件,（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）,（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）,36.5+（-）0.5度,7.2-7.4,O2和CO2（95%空气和5%CO2）,3、条件：,维持培养液的PH,为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？,有些氨基酸（必需氨基酸）动物细胞本身不能合成必须由培养液提供。血清中还含有多种未知的活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,10代细胞,部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代,动物细胞培养不能最终培养成动物体,50代细胞,原代培养,传代培养,细胞贴壁,剥离、分瓶,细胞株,细胞,细胞系,过程,1、大规模的生产生物制品(病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等）2、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。3、检测判断物质的毒性。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为 及其他疾病提供理论依据。,动物细胞培养技术的应用,筛选抗癌药物,治疗和预防癌症,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植株,培养结果,细胞或获得细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,动物血清葡萄糖,植物激素蔗糖,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,探究,1、植物组织培养过程要将组织分散成单个细胞吗？,、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞吗？,、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,、细胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,探究,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,探究,14、如何理解原代培养和传代培养？,15、传代培养的细胞都能一直传代下去吗？,16、有些为何能一直传下去吗？,17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？,18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养,不都能,发生突变，朝着癌细胞方向发展,不是,保存10代以内的细胞，因为1050代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分遗传物质发生改变，发生突变向癌细胞方向发展。,探究,根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达?,想一想,利用动物体细胞核移植技术,动物细胞培养,二、动物细胞核移植技术和克隆动物,完整动物个体,全能性受限，分化潜能变弱,核移植,克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,1 动物细胞核移植概念：,分类,胚胎细胞核移植：,体细胞核移植：,易,难,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度高，恢复全能性容难,高产奶牛（供体）,采集卵母细胞体外培养到减数第二次分裂,M期卵母细胞（去核）,去核的卵母细胞,取体细胞,供体细胞培养,将供体细胞注入去核卵母细胞,用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程,将胚胎移入受体母牛内,生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,二 体细胞核移植过程,(二)、体细胞核移植的过程：,思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。,探究,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同,4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？,在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性,(三)、体细胞核移植技术的应用前景：,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程,2、保护濒危物种,3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植,4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,阅读课本P50页,(四)、体细胞核移植技术存在的问题：,1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。2.克隆动物食品的安全性问题。3.胚胎移植动物幼体产出 概率10,思考与探究,1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？,提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,思考与探究,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,思考与探究,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,知识拓展,3.体细胞核移植技术为什么要选择M期的卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有M期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用M期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于M期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和M期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此，M期卵母细胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。M期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MI期卵母细胞MPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。,也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用M期卵母细胞做受体。,（2013全国卷大纲版）2.关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是 A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C.烟草叶片离体培养能产生新个体，小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖D.动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒,【答案】B,