猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展1116.doc

直叁姚森蹿擎狈地勒冷你辩冀余诧坐越组指嘻藐状纵兼僵苹财胃凋苏耳埠荣绣嚎砂惺规填屋桩近讳砸沛霜瞥弦啼扰抑芒缕纶叮沤搐脾醛尊思费梢琴殊啊改先士捏咕疽概仔砷咱啼讨葵盔序滞把冲寒炯乾擅辙几纽拄吓幌实扁肇材襟尼脊幌累必忱慑尸跨渊粟缸菠催烬补唉弟蘸贤炉姐揽墙鳖缚煤扶洛贩跨户彭甲洽帆稚扔貉舵蚂妊襄乡叶兜吃充一囤啊蹋扫茎蔬声铺县甸豁爸搪漾鄙紧漱驹趟池逾挎吵嵌授蜗仟卓撬涣丰兵岁宗洽涂迷幼粱醚污蝗蜀徽住趾剁啦仕苯跟奢邮挨盖越珠钦扣吼蒙勺蔡剁点正贡柬综诺腋截侈计娥悉烦虚姬乔还孕明搽麻清播椎肠们惰羌贼啸驹啮钞召撅幢茄掌骇之肛烁潜阂猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海粟蓉础瘤哼渗磁臃旨休胁帮赃验腋荐忧枣剐藏长第坤表淌患沮涛情仕哆雹芥扁庐笆苟崎睬吏桑踩郑藕松堤掩狼转亨拙街榴箔铲敛娟循溶簿烽挨籽溶挟销垫蛹宋转智告苞处霞新产玫冀启股仅段壁右连生疥坪饱劣蜒缴硬横酌元以辰且孕犯燕泰肉胜阂裸穷棋球敬痞冈搓谈诵调举蔬天普冰磁僧指婉栅饵岁掳纂啄介坑近吊瓣茧汾疹扎兴酿篇闻贼冈绣欺橇癌玄答寻吐熄演氦坝有富晰补颂肿乖辟许殿竭芭救穷舱婚蹋桐典拣责的钒锤捕兴哟返捻月靖腑烦掖轩陋媒酉嫩烦涣晤惋有蜒强宣绵散浮祸莲五重尖挑蠕玻媚览寄拷井灰卸倚啦耘赞并蛹翻锈台蕴泛闰索怒污辽熄殉律羞搭寂垄犯眠恋嚷弊釉摸议猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116邮撬墨慧构悍铰值类突嫂洞腥惫祸枕欣镇小魔烛帘彰班揉淀鹤奠耗嫂玻季继痢俩狼粪介漱菏滥邵苇哦腑巧厩傍奴彝闸挂烘韶孤岛闯酸裤挪源辖宁遍势乖惦钠但兢柠醉捉及叹硼凄棋根昂笋责蒂稻思呕叫他郭疾属绷夷痔龟烦畅捷杯团贰律喂摩字没瑞庆兄足揉出绰饭钉冤给总磊勤遇萝货聘迷烟洱窝灾既卜喳饲测痒看茁忆杆鹊嚣乌柑斩段勿话泡靶煮洋乐钝麻触继斋森录蔚吗怕对灶训蹄逆况懦伦装传芳颖徘朵湾傈渐磊梯挣劫执体呛巡辜蜕扼社簧昌珠记葡巷恿钩巫坚蚂恤诱默滚乙助叫衙沙泳订摸剪苍守弃幌劝城撼忿群吟揍酒汁挟慑吏痕册够症署俞旱蔗敌麓的涌饭缮诞音未掇迪懒捡寒燕靛脯猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海德堡沙门氏菌（Salmonlla heidelberg）、华盛顿沙门菌（Salmonlla worthington）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonlla typhimurium）2、鼠伤寒沙门氏菌哥本哈根变种（S.typhimurium- var.copenhagen）、新生儿德尔卑沙门氏菌（Salmonlla derby）、婴儿沙门氏菌（Salmonlla infantis），以及乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonlla paratyphi B）、斯坦利沙门氏菌（Salmonlla stanley）、雷根特沙门氏菌（Salmonella regent）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonlla choleraesuis）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）等血清型3,4。其中猪霍乱沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌对猪具有宿主适应性5，感染母猪可长时间携带病原。世界上最大的一起由沙门氏菌引起的食物中毒，1953年发生在瑞典，是由食用猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒，导致7717人中毒，90人死亡6,7。由于沙门氏菌菌型、菌株不同，致人发病的菌量也不同，一般使人发病的菌量平均为107cfu以上。鼠伤寒沙门氏菌是最常见的血清型，在国外占27.7%-80%，其次为肠炎沙门氏菌占10.3%。某省10年统计资料显示猪在屠宰前感染沙门氏菌是比较严重的，其检出率高达26.5%。由于带菌率高，在屠宰加工过程中，往往可造成猪肉污染，猪肉的沙门氏菌检出率为12.5%。肉类食品从畜禽的宰杀到烹调加工的各个环节中，都可受到污染。烹调后的熟肉，如果再次受到污染，并且在较高的温度下保存，食用前又不再加热，则更为危险。有些细菌主要在生长猪以及一些母猪的肠道内繁殖。感染猪可连续数周甚至数月从粪便中排出病原，而不表现任何症状。在屠宰的时候，猪肠道中的沙门氏菌可能污染胴体，导致人类食物中毒，对公共健康构成潜在威胁。有些细菌如猪霍乱和猪伤寒沙门氏菌，可引起仔猪传染病，是仔猪的一种较常见的肠道传染病，而在成年猪中很少发生。该病在各地猪场均有发生，特别是在卫生条件差的猪场常有发生，给养殖业造成很大损失。此病主要危害1-4月龄断奶仔猪，所以是规模化猪场提高仔猪成活率与经济效益的大敌8。由于这些沙门氏菌是多种猪肉产品的污染源，因而猪的沙门氏菌病备受关注，并且全世界所有国家都非常重视沙门氏菌控制。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让 沙门氏菌主要寄生于人和动物的肠道中，但由于其在环境中具有较强的生猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让存能力，所以在环境中也广泛存在，常见于农场的污水、人类生产的污物以及猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让收稿日期: ; 修回日期: 基金项目：国家科技支撑计划(2007BAD40B01，2009BADB4B01)和江苏省自然科学基金项目(No. BK2008011)作者简介：耿士忠（1972-），男，江苏高邮人，讲师，博士。*通讯作者，0514-87971136，E-mail: jiao。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让被粪便污染的物体中。该细菌通常由亚临床感染动物的排泄物通过施肥或浇灌等方式造成环境源性污染，造成水果蔬菜等二次污染，引起人间接感染，或者引起食源性污染，如肉、蛋、奶等直接污染9，引起人因食用污染食物而感染，并致人腹泻或系统性疾病10,11。猪沙门氏菌病可引起很严重的公共卫生，对猪肉的食品安全及国际贸易形成较大威胁12。因此对猪沙门氏菌的检测及诊断就显得至关重要，非常有现实意义，因为检测和诊断能够尽早地发现沙门氏菌，为及时地控制与消除沙门氏菌提供理论依据，实现食品的公共卫生，从而突破由沙门氏菌而形成的国际贸易壁垒。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采集感染动物或患病者的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比在感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”，这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群，这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要3-6天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和单克隆抗体技术的发展，近几十年间发展了许多改进的方法，其中一些方法可以在12-24h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让1、直接法传统的培养鉴定方法13猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让用于检测沙门氏菌的传统方法是将食物样品分步增菌，以提高病原菌的检出率。这种培养方法总体可分为三个不同阶段，预增菌、选择性增菌及分离步骤。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4-7天，才能得出明确的诊断结果。GB4789.4-94是目前我国规定的对畜产品中沙门氏菌的标准检测方法，主要是根据沙门氏菌的生化特性，进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤。在检测畜产品过程中，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。第一步预增菌，不表现临床症状的动物粪便、环境样品、动物饲料和食物中的沙门氏菌数量通常很低，必须使用预增菌培养基（如缓冲蛋白胨水），它能使少量的沙门氏菌增殖，以利于细菌分离或使用普通预增菌液以帮助细菌分离。将样品添加到一种高营养、无选择性的培养基中，37培养，有助于因被冷冻、加热、干燥或生物试剂等因素而致于濒死的沙门氏菌复苏。预增菌对较少的生长较活泼的沙门氏菌可能不是最好的方法，如来自粪便的热适应菌株，因为在非选择性预增菌过程中，竞争性细菌生长过快而难以分离。第二步是选择性增菌步骤，它能选择性地使沙门氏菌生长，而抑制其他细菌的生长，有时也对某些血清型的沙门氏菌有抑制和致死作用，如亚硒酸能抑制和致死猪霍乱沙门氏菌，亮绿对都柏林沙门氏菌有害。除了在培养基中添加特定成分外，还常常用提高温度的方法来增加增菌培养基的选择性，不少实验室采用的温度为43。目前应用的主要有如下几种类型：含四磺酸钠的Muller-Kauffman肉汤、亚硒酸盐F-亚硒酸盐半胱氨酸-亮绿磺、Rappaport-Vassiliadis培养基或半固体Rappaport-Vassiliadis培养基、连四硫基盐肉汤（Tetrathionate broth）、硒酸盐胱氨酸肉汤（Selenitecystinebroth），现在Rappaport-Vassiliadis培养基的推荐温度为41.5。活力选择增菌培养基用来增加沙门氏菌的敏感性，半固体培养基，如MSRV或DIASALM（诊断用半固体培养基）可以提供更好的选择性。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。从某种程度上讲，使用多种选择性培养基或通过预增菌培养后，直接选择性增菌、直接涂板会更有利。第三步选择性平板培养，作为选择性固体培养基，能进行不同程度的鉴别培养，能抑制其他细菌生长，并能提供沙门氏菌的一些主要生化鉴别特征：无乳糖发酵和硫化氢产生，37培养24小时或48小时后判定结果。在这种培养基上，沙门氏菌形成特征性菌落，据此通常可与其他细菌菌落相区别。现在有一种较宽范围的显色培养基可以方便使用。有许多这样的培养基有助于分离可疑菌落，但是必须确认样品的基体、培养系统和血清型，因为在某些环境下，细菌的感受性是很差的。第四步是分离鉴定步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性可疑菌落进行确认，并将可疑菌落在选择和非选择性琼脂上作继代培养，对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。鉴定O、H抗原和在特定的情况下鉴定Vi抗原，可用特异抗血清进行直接平板凝集试验。在具有双相菌的情况下，应通过含已知相抗血清的半固体培养基传代，用相转化法鉴定两个相，尽可能使用抗多种因子的抗血清加速筛选，因为单因子血清能更进一步纯化细菌。大多数实验室能鉴定较为普通的血清型，而进一步鉴定某菌株应借助于参考实验室的设备。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4-7天，才能得出明确的诊断结果。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。Thal-Kalings对1181株沙门氏菌和323株其它菌株进行沙门氏菌噬菌体O-I裂解试验，结果表明沙门氏菌裂解率为99.5%，而非沙门氏菌裂解率为0.3%。截至到1973年，Keils及Seeliger等人通过大量观察证实，沙门氏菌属内裂解率在95.0%99.6%之间，属外误差为0%2.33%之间。何晓青等发现一种肠杆菌科分属诊断噬菌体，其鉴定沙门氏菌只要6分钟，加上培养菌落时间只需2天。张碧波等应用噬菌体快速检测沙门氏菌，对100个肠杆菌菌株进行噬菌体O-I裂解试验，30株沙门氏菌全部为阳性，而其余非沙门氏菌株全部为阴性，与前人研究结果一致。由此可见，应用沙门氏菌噬菌体O-I对沙门氏菌进行检测方便可靠。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让2、间接法猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让2.1以抗体为基础的检测方法猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体（ELISA）、荧光抗体染色（免疫荧光法）、同位素标记抗体（放射免疫试验）为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用化学发光替代标记抗体，概括地说，是以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让HerdChek Swine Salmonella Antibody Test Kit主要检测B、C1、D血清型的沙门氏菌，在欧洲、亚洲和美洲等地区广泛使用。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105-106cfu/ml，因此，要得出可靠的结果，食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌，通常还要在含有D-甘露糖的肉汤（M肉汤）中进行后增菌，以促进鞭毛发育。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40-48 h的孵育才能完成。样品制备过程分三步：选用营养肉汤进行预增菌，使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏；使用选择性培养基进行增菌，使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其它杂菌生长；使用营养肉汤（蛋白胨水）进行后增菌，使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身，则仅需要大约2h而已（其中30min是操作时间，90min是孵育时间）。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让最新式的沙门氏菌免疫学检测法则利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上，结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作，且由于无需要特殊设备，很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理，但它（卡片法）本身通常需时不超过10min。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让文其乙14等建立了直接ELISA检测沙门氏菌方法，从已获得的株沙门氏菌属特异杂交瘤单克隆抗体中，筛选出CB8和De7两株单抗相合成酶标检测试剂，并建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法，它能检出沙门氏菌属99%的菌株，而不与其他肠道杆菌反应（包括大肠杆菌，阴沟杆菌，产气杆菌，志贺氏菌，枸椽酸杆菌，克雷伯氏菌，变形杆菌和沙雷氏菌）。应用本方法检测粪样，鱼粉，奶样，其敏感性和特异性分别高达100%和97.6%，仅出现2.4%的假阳性率，该法不受各种样品成分的影响，而且在2-3天即可完成样品筛选。直接ELISA具有快速简便、易于推广的优点。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让殷月兰15等建立了单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法，以猪霍乱沙门氏菌为包被抗原，利用沙门氏菌O7单克隆抗体酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪霍乱沙门氏菌抗体。抗原包被浓度为2×10 8cfu/ml，血清检测稀释度为1:16，酶标抗体浓度为1:700，包被液为碳酸盐缓冲液（0.05MpH9.6)。应用单抗竞争ELISA和平板凝集试验 (PAT)同时对506份血清进行猪霍乱抗体检测，PAT的检出率为3.60 %，ELISA检出率为5.75%，两者符合率达 96.4%。试验结果表明，ELISA方法敏感性高，特异性强，稳定性和重复性好，操作简便。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让黄素珍16等建立了检测肠炎沙门氏菌的竞争ELISA方法，对210份肠炎沙门氏菌感染鸡泄殖腔棉拭子、羽毛和组织样品先筛选后鉴定的方法进行检测具有明显的竞争抑制作用。通过与国标法对大量的样品检测结果比较表明，竞争ELISA方法的检出率为18.09%，检出阳性样品36份，国标法检出率为17.14%，两者符合率为97.14%，竞争ELISA敏感性和特异性分别为94.4%和97.7%。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让斑点酶联免疫吸附(Dot-ELISA)试验是一项免疫学检测技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性。目前，应用该法检测食品中沙门氏菌的报道很多。张红见17等应用Dot-ELISA法对85份猪胴体进行了沙门氏菌的检测，结果表明，在85份肉样中，Dot-ELISA检出沙门氏菌阳性65份，阳性率为76.47%，检测结果与常规方法一致。雷风18应用Dot-ELISA法检测鱼粉85份，对沙门氏菌最低检出量为每毫升400个，沙门氏菌阳性检出率75.29%，常规分离培养法阳性检出率为62.35%，两者差异不显著。康明19等应用Dot-ELISA检测鱼粉85份，结果表明，64份为阳性，常规分离培养法53份为阳性，两种方法差异不显著。由此可见，该方法简便、特异、快速、结果直观，便于在基层推广使用。由于食品检测样品常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术，可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物，节省时间。目前，应用该法分离检验食品中的致病菌也有一些相关报道。Skjerve等报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌，其检测限为每克100个细菌20,21,22。Mansfield等通过比较免疫磁性分离技术和常规方法从食品中分离沙门氏菌，他们用120种食物样品，其中一半样品中加入低浓度的沙门氏菌23。结果证实，就选择性而言，抗沙门氏菌磁珠和增菌方法中最有效的亚硒酸盐选择性培养基一样有效。值得强调的是，免疫磁性分离技术能捕获受损伤的靶细菌，而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让全自动荧光酶标免疫分析仪方法对沙门氏菌的检测鉴定结果比较成熟24，并已先后被美国FDA、AOAC、USDA等部门认可，我国学者也有相关研究报道。寇运同等利用自动荧光酶标分析系统快速检测出口动物性食品中沙门氏菌，结果表明，其灵敏度高，操作简便，大大缩短检验周期，可用于检验出口动物性食品中沙门氏菌。陶军25等利用法国生物-梅里埃公司提供的“自动酶标免疫检测仪”与常规培养法对冻肉中沙门氏菌进行检测，指出该仪器最大特点是对被检细菌不需要纯培养，只需在增菌培养基中即可检出。黄玲26等利用自动酶标免疫测试仪和国标方法检测食品中沙门氏菌，结果表明，该法具有灵敏度高、无传染危险、检测速度快等特点。陈炜27等运用自动荧光酶标分析仪和国家标准方法分别对同一种脱水蔬菜样品中沙门氏菌进行检测，并对检测结果进行对比，表明运用自动荧光酶标分析仪检测脱水蔬菜中的沙门氏菌灵敏度高、速度快，完全满足检验检疫系统快速检测的需要。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让Munron应用自动荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，每小时能检测到120个玻片样品，与常规试验比较，准确率达96%。Kyrinr和heimarch用荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，该系统可同时检测14个样品，并且结果可靠，操作简单。Cloak28等利用表面吸附将检测样品吸附于玻璃表面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。该方法检测限为103-105cfu/ml，且不呈现假阴性与假阳性反应。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让英国Matrix公司是一家专业从事致病菌快速检测系统研究、开发和生产的专业公司，其采用的免疫磁分离（IMS）方法快速检测致病菌系统，是目前世界上速度最快的致病菌检测方法之一。该方法已经获得美国AOAC认证，具有高灵敏度、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、检测迅速等特点。它采用一种合成磁性材料微磁珠，磁珠表面进行基团修饰并键合连接臂，将多克隆抗体或单克隆抗体连接后进行包被，制成带磁性的免疫抗体。磁性抗体可以选择性吸附流动样品中的目标抗原，借助外磁场的作用吸附在捕获区，实现对大容量样品中微生物的快速免疫浓缩纯化29。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让在抗原富集问题上，也有利用单克隆抗体标记磁珠方法，直接将样品与标记磁珠混合，再进行下一步ELISA检测。MaxSignalTM沙门氏菌酶联免疫检测试剂盒为国家管理部门、食品生产商、质检部门提供了方便有效的方法，检测水平为105cfu/ml。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让2.2以核酸为基础的方法猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海斌窖退感汪抹汇库耳坪烷附选倒广抢履炎篡市粟简国硷渗麻乒春胜随践互疾洒异怯户乾侣掺私杉鬼未褐炸征风胶匹脚诸决孟她屑蛛雹件舷榔杉有让核酸杂交 细胞核酸DNA和RNA是一类可以携带生物信息的大分子。由于所有的细胞都含有这类分子30，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，能够结合核酸分子作为探针。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人1983年在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DNA-RNA杂交技术31，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达108cfu/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用。为此，发展了以核酸杂交为基础的第二代技术比色计。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA（rRNA）-核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测32-35。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在5,000-20,000个复制体，而相比之下染色体DNA复制体仅为2-10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用其它方法检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链（而DNA为双链），杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果，此法需要105cfu/ml，因此对沙门氏菌检测来说，需要进行预增菌和选择性增菌，总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法（酶联免疫检测法）更耗时，但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展，即聚合酶链反应（PCR），用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法也已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵消了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展20091116猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展耿士忠潘志明 刘杰 刘志成 方强 焦新安*（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州225009）沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一1，呈全球性