VEGFC在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响PPT文档.pptx

研究背景,宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。WHO报道：全世界发病人数为45万，我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预后的重要因素。（曹泽毅主编，中华妇产科学，2004）,肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其复杂的过程。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现，淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又一热点，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善患者的预后。目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在VEGF-C特异性与受体VEGFR-3 结合，诱导淋巴管生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。,血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的VEGF家族的新成员，是特异性淋巴管生长因子。在近50的人类恶性肿瘤中表达。VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，主要表达于正常组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及人的肿瘤细胞。,（M.A.A Al-Rawi.et al.Histology and Histopathology 2005）,(Marc G.Achen et al.Cancer Cell.2005.),研究设想,VEGF-C,淋巴内皮细胞,肿瘤细胞,?,肿瘤淋巴转移,实验方法,体外培养Hela细胞,脂质体介导寡核苷酸转染 24h、48h、72h,荧光定量RT-PCR检测VEGF-CmRNA,MTT法检测细胞生长,间接免疫荧光染色和流式细胞术检测VEGF-C蛋白,黏附实验,Tanswell小室侵袭实验,材料,1细胞株 人宫颈癌细胞株Hela由四川大学华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。2主要试剂及其配制兔抗人VEGF-C多克隆抗体（北京中山金桥生物有限公司）标记FITC羊抗兔二抗（北京中山生物技术有限公司）Matrigel(美国Collaborative Research公司)ECM胶（extracellular matrix）E1270(美国Sigma公司),纤维粘连蛋白FN（Roche公司）VEGF-C寡核苷酸：（由北京赛百盛生物技术公司合成）反义链5-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3，两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸251271，在5端标记 FAM，正义链5-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3，两端各3个碱基进行硫代修饰。,阳离子脂质体 Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠）Transwell小室（3428型，孔径8um，美国Corning-Costar公司）引物：VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司合成，其氨基酸序列及其产物长度如下：,实验仪器,FTC2000 荧光定量基因扩增仪MSE Micro-Centaur Centrifuge 微型台式离心机水平电泳仪（美国BIO-RAD公司）Gel Doc 1000凝胶成像系统微量移液器（法国Gilson公司）Elite Esp型流式细胞仪,VEGF-C反义寡核苷酸的设计,反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书馆的GENEBANK数据库中，查找到人VEGF-C的基因序列（NM 005429）。根据设计原则：长度在1520bp、修饰；G+C的比例：40%60%；避免4个碱基以上自身反向互补序列；避免4G堆积；避免六个以上的回文结构等。,设计反义链：5-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3；正义链：5-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3，为提高对核酶的抗性，在两条链的两端各3个碱基硫代修饰。确定序列后，常规进行人类基因组同源性分析，即：通过Blast分析，证实两条链与人类其他以已知基因无同源性。为便于观察寡核苷酸转入细胞的效率，在反义链5端标记了羧基荧光素(FAM)，FAM的激发波长是480nm，发射波长是520nm，在荧光显微镜下是绿色的。,MTT法检测Hela细胞黏附能力的变化,包被基底膜,接种细胞,MTT比色法检测 黏附率（OD值实验组OD值BSA组）/OD值BSA组100,10g/L BSA；50mg/L Matrigel1:2稀液；10mg/L FN，以50ul/孔分别加入96孔培养板，4过夜，BSA为对照基底。,水化基底膜,吸取培养板中的液体，加入50ul含10g/L BSA的无血清高糖DMEM培养液，37，孵育30min。,细胞体外侵袭力测定,Transwell,高糖DMEM,1:1条件培养液(NIH3T3)及高糖DMEM2.5ml,ECM包被孔径8um的滤膜,Hela细胞,24h、48h擦去上室中的细胞，HE染色，计数穿膜细胞数.,三、统计学处理,所有资料均用SPSS10.0软件包进行处理，采用t检验和方差分析，检验水准定0.05，若P0.05，认为差异具有统计学意义。,结 果,图1 VEGF-C在宫颈癌Hela细胞中的表达 LsAB法 400,图2 FAM标记的反义寡核苷酸转染Hela细胞6h后 100,1、VEGF-C在Hela细胞中的表达,2、寡核苷酸转染后VEGF-CmRNA的变化,标准模板的荧光定量PCR标准曲线,表1 转染后细胞的VEGF-C mRNA的表达,在转染24h、48h、72h后，反义组VEGF-C mRNA的抑制率与对照组和正义组相比，差异均有显著性（P0.05）。,3.寡核苷酸转染后VEGF-C蛋白的变化,表2 转染后细胞中VEGF-C蛋白表达（平均荧光强度）,*t=7.74*t=26.94*t=10.23 三个p0.05,24h,24h,72h,48h,图3-5 VEGF-C反义寡核苷酸转染Hela细胞后VEGF-C蛋白的表达（平均荧光强度）,4.寡核苷酸转染后对Hela细胞生长的影响,表3 转染后各组细胞在不同时间段的OD值,5.寡核苷酸转染对细胞黏附能力的影响,表4 细胞对基质成分的黏附能力（光吸收值A）,黏附率（OD值实验组OD值BSA组）/OD值BSA组100,图 8 Hela细胞黏附实验,图 9 VEGF-C反义寡核苷酸转染后Hela细胞黏附实验,6.寡核苷酸转染细胞侵袭能力的影响,表5 不同时间三组细胞的穿膜细胞数,*t=2.8055*p0.05；*t=3.4190*p0.05,图11 Hela细胞穿膜48小时 HE400,图12 反义寡核苷酸转染后Hela细胞穿膜48小时 HE400,讨 论,1VEGF-C在Hela细胞中的表达,Ueda等研究了16种妇科肿瘤细胞的VEGF-C的表达和侵袭活性的关系，表明宫颈癌Hela细胞内VEGF-C高表达，具有更强的转移和侵袭能力。本实验通过荧光定量RT-PCR法，检测到VEGF-C在mRNA水平的高表达;采用免疫细胞化学法及间接免疫荧光标记和流式细胞术，检测到VEGF-C在蛋白水平的高表达。与上述研究结果一致。,2.VEGF-C反义寡核苷酸转染后对细胞 内VEGF-C的影响,反义寡核苷酸技术属于反义核酸的一种，是通过各种机制，在核酸水平上有效的关闭某一特定基因，抑制该基因的表达，从而达到阐明目的基因功能的目的，进而成为特异性治疗疾病有效方法。,（CohenJ S.Pharmacol T-her,1991）,2.1 VEGF-C反义寡核苷酸对细胞的VEGF-C mRNA 的影响,本实验证实：VEGF-C反义寡核苷酸能有效封闭VEGF-C基因，抑制了其在Hela细胞中mRNA水平的表达。在24h、48h、72h三个时间点，VEGF-C mRNA的抑制率分别为35.71、72.30、47.40，48h抑制最为显著，72h抑制减弱。,反义寡核苷酸对VEGF-C mRNA抑制作用的时效性，说明反义寡核苷酸在72h被代谢失活，对VEGF-C的抑制作用逐渐被解除。反义寡核苷酸抑制VEGF-C mRNA的表达，可能是通过Crooke等研究的反义寡核苷酸的作用机制：反义寡核苷酸与DNA双螺旋形成三螺旋，从而阻止DNA的转录。反义寡核苷酸与核内不均一RNA(hnRNA）结合，使其不能正确的剪切，成熟mRNA不能形成。,2.2 VEGF-C反义寡核苷酸对细胞VEGF-C蛋白的影响,VEGF-C反义寡核苷酸转染后对细胞VEGF-C蛋白表达的影响与对细胞内VEGF-C mRNA的影响是一致的。其可能的机理为：反义寡核苷酸抑制了VEGF-C在mRNA水平的表达；进而影响VEGF-C在蛋白水平的表达。有研究表明：反义寡核苷酸与mRNA、核糖体rRNA结合，蛋白质翻译就不能正确启动。(Douglas WG,et al.Am Coll Surg,2000),3.VEGF-C反义寡核苷酸对细胞增殖的影响,细胞增殖是转移的前题，本研究各组细胞的生长曲线，反义组细胞的生长受到抑制。Dayanir等研究表明VEGF-C通过PI3K途径，激活抗凋亡蛋白Akt/PKB,上调抗凋亡蛋白bcl-2促进肿瘤的生长。VEGF-C也可通过IP3/DG双信使途径升高Ca2+，产生PKC，PKC通过Raf-1-MEK-ERK1/2途径，增强细胞的增殖。,4.VEGF-C反义寡核苷酸对细胞黏附能力的影响,FN和LN（Matrigel的主要成分）是基底膜及细胞外基质的重要成分，肿瘤细胞侵袭基底膜及细胞外基质，通过黏附于基质上而产生迁移，使肿瘤扩散和转移。实验结果表明：转染了VEGF-C反义寡核苷酸的Hela细胞的黏附能力下降。曲明阳等人将VEGF-C反义寡核苷酸转染乳腺癌细胞MDA-MB-435，细胞的黏附和侵袭能力下降，与MMP-2蛋白的表达下调有关。,5VEGF-C反义寡核苷酸对细胞侵袭力的影响,将ECM胶铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜 上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。转染了VEGF-C反义寡核苷酸后，Hela细胞的侵袭力明显下降,同时也说明了VEGF-C对促进Hela细胞的侵袭能力。,总 结,研究表明：VEGF-C在宫颈癌细胞Hela高表达，通过对Hela细胞自身增殖、黏附、侵袭等生物学行为的影响及进而调控肿瘤的转移，这可能也是VEGF-C促进宫颈癌淋巴转移的机制之一，这一推论还有待体内实验进一步证实。本研究以期为通过抑制VEGF-C，靶向性阻断宫颈癌淋巴转移的可行性，提供实验依据。,The end&Thank you!,