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常用的血细胞分类技术,1.组织化学或细胞化学染色(histochemical or cytochemic staining)2.电子显微镜技术(electron microscopy)3.流式细胞技术(flow cytometry)4.单克隆抗体技术(monoclonal antibody)5.免疫探针技术(immune probe)6.密度梯度离心(density gradient centrifugation),密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。介质(media)的要求：1.能产生密度梯度 2.密度高时，粘度不高 3.pH 中性或易调为中性 4.浓度大时渗透压不大 5.对细胞无毒,梯度离心常用介质,蔗糖(Sucrose)主要的不足表现为：1.高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗 透压不适，而导致被分离物损伤。2.分子量过小(342)易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。3.高粘性盐(Salts)常用的有CsCl,K-tartrate 和 NaBr,主要不足同蔗糖1，2。多聚蔗糖(Polysucrose)即所谓的Ficoll,分子量为400000左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压，但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不 易脱糖。,碘化物(Iodinated compounds)常用的有：Hypaque(泛影钠)，Urografin(泛影葡胺),Metrizoate(甲泛影钠)等。混合介质(Mixed media)常用的有：Ficoll-Paque,Histopaque,Histoprep,Lymphoprep等。硅胶(Colloidal silica)即所谓的percoll，“Of all substances tested,none came closer to providing all the desired characteristics than colloidal silica.”,Percoll理化特性,平均分子量6106,渗透压20 mOsm，密度1.13g/ml.pH中性，生理盐水配制的percoll应用液等渗.平均直径10-30nm.硅胶经处理后，对细胞无毒性.（注：硅溶胶对细胞有毒性）主要是在SiO2 coated一层聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP),A:0.15M NaCl,35nm,B:0.25M Sucrose,30nm,Percoll 的使用,市售原液 1.100%percoll原液 使用时percoll原液:10生理盐水=9:1配制成percoll应用液，再用生理 盐水将percoll应用液调制成各个梯度。2.已经用10生理盐水配制好的percoll应用液 使用时只需用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度即可。梯度设置 1.Step gradients(不连续梯度),2.Continuous gradient(连续梯度)(1)高速离心(2)梯度混合器,样品的放置 1.与percoll液混匀 2.置于梯度顶层 3.置于梯度底层 需用较大的离心力样品的收集,Percoll在贝类血细胞分选上的应用,Separation of European flat oyster,Ostrea edulis,haemocytes by density gradient centrifugation and SDS-PAGE characterisation of separated haemocyte sub-populations Qing Gang Xue,Renault Tristan Fish&Shellfish Immunology(2000)10,155165,血细胞样品处理上Percoll梯度：10%，30%，50%和70%结果：10/30%界面处形成一带(P1)，50/70%界面处也形成一带(G)。上Ficoll梯度：5%，10%，15%和20%结果：5/10%界面处形成一带(F1)，10/15%界面处也形成一带(F2)。血细胞染色SDS-Page,P1,G,F1 Large hyalinocyte,F2 Small hyalinocyte,欢迎大家批评和指正！,
