最新Kupffer 细胞 分离 培养PPT文档.ppt

肝脏细胞悬液制备,门静脉穿刺，以10mlmin流量经门静脉灌注PBS，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml 0.05的型胶原酶溶液(sigma，PBS液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。取下肝脏加入20ml 0.05胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。PBS稀释至50ml,300g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50gg 3min,4oC离心，弃沉淀，将上清液以300g，5min,4oC离心，取沉淀。,用镊子划碎肝组织,装入试管消化,肝脏消化吹打后细胞悬液,细胞悬液过滤,洗涤与肝细胞沉淀,梯度离心,Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50的SIP，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加2mL25的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4管）。500g，离心15 min，4oC，50的SIP和25的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍，弃上清(300g，5min)。,非肝细胞SIP离心准备,SIP离心后细胞层与洗涤,细胞贴壁,把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37的PBS液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。,刚分离出的细胞,KCs的培养方法培养,5CO2、37、95湿度。换液间隔时间为2d。培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清（HyClone）。,2天及3天KCs,2周及3周KCs,KCs的鉴定活力判定,通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠），CD163免疫组化鉴定KCs（大鼠）,阳性为KCs。,KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片,F4/80的免疫荧光和CD163免疫细胞化学(x400),致谢,感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。,