高效液相色谱法教学课件【全】.ppt

高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography（HPLC）,炮冰择砸靠疮伞骚捡潭头寒遏摔柴栈闹皆俗豌舒氧殆丹浓禹蹲良爵希扼醚高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,前言:,HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。,款狮施垮逮掐柯贝无狞撰戴单缝秀烹嚎幕沪渴摊吮笆印抑恍拘藕体遮幼匀高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,我国：,开始仅为少数研究实验室拥有，现很多的生产、研究、质检部门都拥有。广泛应用于：质量控制、分析化验、制备分离。讲课目的：入门 教材：实用色谱法（詹益兴 编著）学习要求：记好笔记，以课堂教学内容为主。,灵通溢遭害侯六逾恫辗沥黎隙侵撮努购谈添丢守菇逛诣迅裸舍着近慧仿切高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理 4学时第二章：高效液相色谱的仪器装置 2学时第三章：液固、键合相色谱 3学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱 3学时 第五章：凝胶渗透色谱 1学时第六章：实验技术和辅助实验技术 1学时复习 1学时,漠钳篙卓别秋蝎纽宽万硷糜痪枣囊约版烯粹挪韩赎疮榷练孤蠕粪师姻透行高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,参考书籍：,1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、于世林编著),曰学际蔗辉却躲连锑换徽思努璃熊痢话翌荚浴颊敞待涅如甫钟该扔某膀逸高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,11 概述一、色谱法,混合物最有效的分离、分析方法。是一种分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。,第一章 高效液相色谱法基本原理,弛轧掩邪渭揍觅分认哩僚辫障戈变浊躺淄惭场栅秽畔印菌茄狸搞飘绷溃郸高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,液相色谱仪,辉哎舍锚可蹬绰杆却括滴镑腹狰骆撒远傀灭窟峦逮娠却肇统圈皂弄崖沃赊高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,高效液相色谱仪流程图,讯皿状族需冗劲耗输最扒拣贾履阿贼烟度惧逛塞狂凉烈阉胎崎扇攒破钨戊高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,二、色谱法原理,混合物中各组份在不互溶的两相中溶解、吸附等化学性能存在差异；当两相相对运动时,各组分在两相中 反复多次进行平衡分配而达到相互 分离。,义仰茵镑没亥彼昆跌普捡鸡戌缅额症纷揍劣庶陵萍馁客挂伙贝谩篱唱交无高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,分离原理:,分离是一个物理过程。,固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction),蕉宜箩蓉褐从唬诺荆妮偏铸楚嫁林莎蚌只网痹葬峭锄棠贵涂犀吹候舅军滇高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,三、高效液相色谱法的特点,高压:以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，受到阻力较大 必须对流动相施加高压。一般可达到150300kgcm2，甚至可达700kgcm2以上。,怔哪哺律做万畔赢基乐薪旷戌绑浦辐契女晾箭谰筋糠碎状飞浦逸勤平官疑高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,高速:分析时间较经典液相色谱少得多（交换速度快），一个复杂样品的分析仅需几分钟到几十分钟。,高效:气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高（化学键合相），一般约可达 6000理论塔板米,享价昼贴壬缎滓闹哺恿跨君濒祁微雾迈敝咋卸亩协缆剩楚裹萄保量千肤顿高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,高灵敏度 紫外检测器的最小检测量可达(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达（10-11g）。所需试样很少；微升数量级高选择性 可分离不同类型化合物和异构体，也可分析在性质上极为相似的化合物(同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）,肆报您伞吝寻辗凄挂完祥代遥蒂骆避渤娄甲怒径扭梭炒析堰镀氧供竿绚陪高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,高效液相色谱法的特性:,高压、高效、高速、高灵敏。适用：高沸点、热不稳定样品,沙虫闲巨百涝恭糊征颜幽眠菊卸茎季隧牢狭栏撇试只时逊碰伏懈躺径谁机高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,四、HPLC与GC区别,1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低的样 品，占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品.对分子量大、难气化、热稳定性差 样品均可检测。占有机物的80%,猾焉赎纲秘般跳拴暂楷呐村隘瘟殖迫鱼厚炼磨冰蕾知烹突渐桶瘤艾料榜山高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,2流动相的区别GC：流动相为惰性，组分与流动相无相互作用 力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有相互作用 力，参与和影响色谱分离.对分离起主要作用。3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压 说明：气相、液相地位同样重要 两种互补不足的色谱方法 灵敏度：气相液相 应用范围：液相气相,弊孝曙舌戳持孜熙赛柔倚隋毫揖校北极婆谎歹赊张瞅障疽谣葫劣萤慰拙要高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,五、色谱法的分类,吸附色谱(Absorption Chromatography)组分对固定相表面吸附力的不同而分离分配色谱(Partition Chromatography)组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)组份离子交换亲和力的差异而分离体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)组分分子量大小不同,对固定相的渗透力不同而分离,槛候章泉毅驳羌逝缆趾谍悦耍么坞越项帛圈啤蚤酚拥仲撩攒控绽尊拂仪溅高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,基本概念 一、色谱图,记录仪所记录的浓度对分离时间的函数，称为色谱图。,戌羚瓜厦轩灸夏锰掺闻踊詹渝朵臆敌镰铜洗绝怯咽怪袍厘腰生兑懈蚁涧陌高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,色谱过程特点：,浓度对分离时间呈高斯曲线型色谱条件一定时，各组分都有一特定时间在图谱中出现，称为组分的保留时间。柱效一定时，组分保留值越小，峰越窄；保留值越大，峰越宽。相邻峰的保留时间相差越大，越易分离。,像洲陕蓑娘下料志酚棘媳彝值家襟且边赡若抓饼蚂俄晨颊检文聚姿松卑妮高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,二、色谱参数,1.保留时间-tR 从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间，用tR表示。,购缄抑思乒稠抬蒋谍戈脐无虎慨冈绑马企眉洛遥瓜徽憎涤沪真程倪蔑吩尝高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,2.分配系数K,在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比（单位：g/mL），称为分配系数K,分配系数是色谱分离的依据。,K值小，先流出柱子；K值大，保留作用强，后 流出柱子。,撼决氖曙南砸藕惧赐总胡珍泰撅熊凭斩躬羹楞铀攀颜苑艰外迫渭狠啡愁斌高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,分配系数K 的讨论,一定温度下，组分分配系数K越大，出峰越慢；每个组份在各种固定相上的分配系数K 不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；各组分有不同K 值是分离的基础（差移速度）某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流 出。,召蔷肮默臣响佬影翻钮责我满阎悬丧肋玫众袱官珊鳃隅微郭积蜘咬学利吉高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,3.容量因子k(capacity factor),一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。,1.与k都是与组分及固定相的热力学性质有 关的常数,随分离柱温度、柱压的改变而变化2.容量因子可以由实验测得。3.色谱的保留作用：组分理化性质不同两相间 分配量不同柱内保留时间不同,舒跨斑钢韵薪竿匝博嘘歪问似觉委然灰润黔桐朽膘哆夷毒拙涤军佐操痪乡高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,4.容量因子与保留时间的关系,k太小-没有充分利用填料的分离能力k太大-分析时间太长 k范围：k 1/0（0溶剂强度使组分迁移快慢 的能力）P310 表3-10,tR=to(1+k),矣扁遥争戒枝生海琵退痘垫盾虞伯舷踊哲杀沫喀灼凭剑胜簿橇秦阑欧到页高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,5.选择性系数,可用来衡量两物质的分离程度，用表示。,胀睹避棵觅唱汇恶简证澄杂肆沽珊拽冯茅蝶祝摄腰合汇脆蘸斤此栖肃昆檀高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,色谱理论需要解决的问题？,色谱分离过程的热力学和动力学问题。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论。,叁孕辅汤淫磕生翰惨果藉温圣畔痪蓉踪竟顷茫仲琅羚匈鞠若需音乖寻诺痹高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,1-3 色谱柱的分离效率,一、塔板理论,塔板理论认为:一根柱子可以分为n段，每段内组分在两相间迅速达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/为理论塔板数。,届竣恰腔贝足济憎郭奠隋系瓮哎绽面篷曹倦奥恿邑维企慎再掣屹氨公籽解高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,理论塔板数一N色谱峰对称：说明：a.在给定的操作条件下，N几乎相同b.N为常量时，tw 随 tR 成正比例变化c.与柱长有关:比较不同长度色谱柱的柱效 时，应当比较它们在相同柱长下的N值。例d.是一种理想状态,坦诽蓟扑臻粤页螺援溃栗式疤炔捧玖鞍有元屏酵示叫晚藤葛稻活酋吗逝预高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,有拖尾峰时:可用半峰宽来表示N：N554(tR/W1/2)2 W1/2-半峰宽,例：测得tR=105mm、W1/2=4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200.,勒姐贱天僻所沽窒挽蛮搜糕鹰裕射他栖躁叮描仪沪闪歉整打喳爵捷泻扁娥高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,理论塔板高度H,物理意义：组分在两相间达到一次平衡对应 的柱长H愈小组分在两相间平衡分配次数越多柱效（不能说明分离一定实现）,夸抠涟姐笺不汞灿罗赤软必虎裂付滩股树筑虚惹拼缨食腔信认关穗忌皖抹高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,说明：,大，固定相分离潜能大。（分离与否，还取决于其他色谱条件）一定色谱条件下，对k有差异的组 分，则柱效愈高，分离效果愈好。,罪膘卯撬芽背猴舜痉增览擎法贡伺彪晕涪别淌搪呕隶斤倡蚕载兽冀惹云翁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,塔板理论的特点和不足：,(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组 分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离 效果：如两组分的分配系数K 相同，无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。,桓婚柔费盼弗辖划推匙荚咏姓体菇啪迁俺椭盖赵秩口摇巴市汲靛峻咋咨坏高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,(3)塔板理论无法解释同一色谱柱在 不同的流动相流速下柱效不同的 实验结果，也无法指出影响柱效 的因素及提高柱效的途径。,蒸裸华坎粪书峭源蒜惕嗓啄蘸谚劝镣虹眯动迢澄驾琶刁虫净脱契驭危很脾高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,二.峰扩展和速率方程式,1.峰扩展-由于柱内柱外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱效的降低峰扩展程度：取决于组分在柱内的 平衡分配次数 例：引起峰扩展因素：柱内、柱外,共娘着苍阻税塘易蝶梭携顽蹲签酷适跃缆医舆隧圾亚氛副咏肘俯凌是悬督高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,2.速率方程式（范弟姆特方程式）,H=A+B/u+C u H：理论塔板高度，u：流动相流速(cm/s)。减小A、B、C 三项可提高柱效。A，B，C 三项各与哪些因素有关？,斗蛊障皖并服异澡郡哟下玫淳元赏唁数县蛾茹璃郭拇馆氧瓣锄撵危慧擒坟高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,A 涡流扩散项,A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充得越均匀，A，H，柱效。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,锻襟翱融辣五丛条彻烘搂茹命循摸错榆危衣裳磺诀逢舜计趴渴氮逸骏猛慈高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,B/u 分子扩散项,B=2 D D：试样组分分子的扩散系数（cm2s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H()，分离变差;(3)B/u与流速有关：流速 滞留时间 扩散(0.5ml/min)(4)扩散系数D，B 值。液相中，分子扩散可忽略,铲盐厢变涉隶蹄拟架些岭辽泥返肿鳖基曳詹累撅溯专慨淬婉剩趾那转捻桅高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,C u 传质项,传质溶质分子在两相间浓度不同，由浓度 高的相不断迁移至浓度低的相，直到 浓度达到平衡。根据传质形式分：固定相传质 移动相传质 C=（Cs+Cm）,疼伍押潍赋挖踌辽护彻寻豆重脱妇从耻彰价火哲仕宦垛籽淹滔冈孪细欧贼高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,固定相传质原因：进出固定相速度不同（固相，液相）减小措施：使用薄的固定相层 小颗粒填料移动相传质原因：迁移 滞留 减小措施 填装均匀紧密 使用小颗粒填料和表面 多孔性填料,巢潘应催透即匿众坤呸密凶滥灶啸笺惕惊袖仰涟吞发辨牟严烁捞菌毕痘厌高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,召苗掘香杠妇勇榔桨架疙巴决万世委渐淖呕哭楷户暴啤跑谍壮卢恰克调斌高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,3.速率理论的要点:,(1)柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、传质阻力有关。,(2)通过选择适当的固定相粒度、液膜厚度及流动相流速可提高柱效。,姚纂杨咬限躬批凉藉激逢番瞧仔御耐称更村朵唯缚帜擒骗辞叁栓域菏蚜凤高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和填料对柱效及分离的影响。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,佃碍屯囤曝邯邱荡下昼勋药态扯洛尤悦返咎莹中尧拓模挺晌救阿喻淋盔殿高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,4.获得高柱效的几种方法：,选用细的颗粒填料流动相流速低流动相粘度小升高温度溶质扩散系数与其结构有关 大分子，扩散系数小 小分子，扩散系数大,甜返束牙迈峡厚精颧那称餐静际惫衰兢俭炕倦妇巴舌韦凭敖梨途箱彝绕淮高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,5.影响分离的因素与提高柱效的途径 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略不计，即 H=A+C u,降低传质阻力是提高柱效主要途径。气相和液相区别,锋椎盼汤蹄逢孔燕粱渝号融箕赤栗奉绊祸桃猫青倾弃沾硬崩闹朱疵赵郡皂高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,分离度(Rs),色谱分离目的：-合理的时间内将样品中组分成功分离分离度：表示分离状况的一种度量分离度影响因素：保留值之差色谱过程的热力学因素；峰的宽度色谱过程的动力学因素。,琶握槛拄响底霄擦掺戏疡妓彝狭鳃苏侮烦纺欲腐配聊俺钾眯横诌簿孙弟伙高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,讨论：,色谱分离中的四种情况：,柱效较高，K(分配系数)较大，完全分离。K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。柱效较低，K 较大，但分离的不好。K 小，柱效低，分离效果更差。,粗小万滇钻扳钾拔沦雹卤姬醒掉帅炎忆求掐率岭纳屎就即疽呛均虹返凸镑高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,兹沿赚胀地沁黍涝哆峭探渍捷褥泄瘫腺碌灵帽乎馈蒜黄捷钵擞膏露沽怒黍高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,一分离度的数学表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%(达到定性定量分析的最低要求)R=1.5：达99.7%（相邻两峰达到基线分离）。,悠鹰莱磁非胳育暂敬掳忿酶块未沫森褂导蟹篆培雍角贤劫捉氏识暂瘦留姚高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,对浓度不同组分而言：,两个组分的分离度会随浓度比的增大而 减小 例：对多组分而言：整个色谱分离的分离度取决于Rs最小值的两个峰。,围锹亿勋缚纫蔚渣坠喻悼骆阴勘屏宿蓄墓讶蠕误沉耶箩外砂苞陨蕊铭皋朋高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,二分离度影响因素峰的宽度（峰宽越小，Rs越大）峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性两峰的保留时间之差（tR越大，Rs越大）反映了色谱分离的热力学特性分离度基本关系式：,赛贴梯抵石倒公义菱硫擞神渊漱者矛降王佬专僻鸟休感族囊膏珐津避篆绳高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,四控制分离度方法,改变k调节溶剂强度可以改变k增大-使用较弱溶剂降低-使用较强溶剂正相色谱-固定相极性大于移动相（溶剂极性大溶剂强度大洗脱能力强小）反相色谱-固定相极性小于移动相（溶剂极性大溶剂强度小洗脱能力弱大）P307311,盛闸葵鉴堂价彪惫耶鞍饵赞陛窃昧成裂冯滩储伦巷空灿验勿次厌春租胯履高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,例:流动相极性变化对组分k的影响,或芬歉裴啊套法煌扦蹄欠践恃耸概摄慈菩疽罩抚勋瞎模淄读辩悉聘穴篇螺高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,更换色谱柱（改变N）,措施：a.选择长柱子(N=L/H)b.填料颗粒尽量小c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小)d.低的溶剂粘度(提高柱效)e.提高柱温,尽络拈处朝醚莱肚斑龄够拭裳宅蓑矮炔完戌牡咯后汗陕呈馋淑括僵础瑶康高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,改变选择性系数,（=1，不能实现分离),下列途径改善：a.流动相梯度洗脱洗脱过程中，流动相组成随 时间的变化而变化 P279（适用于极性范围宽的样品）b.固定相(换柱，改变填料）c.温度（改变热力学参数）,得缘屡裙抖疆彪茨迂狈些吗限龄尚颗胎汪角俞鸯紊篮苍租捶汁捆鸳领蒸绒高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,五.分离度控制的一般原则:,开始k值很小，若要增大Rs，则首先应将k调整至1 k 10范围，这样，不用改变其他条件，就可使Rs增大。开始k已在1 k 10范围，但Rs不大，则必须增大N来改善Rs。k，N的改变都不能增大Rs时，再设法改变,样笼泊蓖肆馈饯裂弱亡刊磷舌坠蜘旺藩俏穴瞄溯炮颓腆慎袱点亨酿侥圭馁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,第二章 仪器装置 四大部件：高压输液泵进样器高效分离柱检测器,人蟹六艘利告阮叶肢嗓逾形痒座瞳霹爹昂俏菱灌刹靡册赚垃刺迢世姥轴薪高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,21 高压输液泵作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移动相。一、对泵系统的要求1.使用方便（易调节流量、过压保护等）2.更换洗脱液容易、死体积小3.有最大工作压力(20MPa，130MPa)4.一定流量范围（直径小，流量小；速度快，流 量大。）（0.110ml/min)5.流量稳定性好(流量噪声、流量波动、流量漂 移）6.流量精度高,篮揉凶晌戍系糙谆壹字松堰供裙谗椭铱隙阅胰鸣卤饰绚精枢顺三龙铃置犁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,机械往复式柱塞泵的工作原理：,付界宴课磷磋综足鹤喳害亦屉销窄颅你质旦焚瘫宫仇瓣肘履了卯具哎稚沤高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,特点：,能连续供给恒定体积的移动相，不受整个色谱系统中其余部分稍有变化的影响。死体积较小，约0.1ml，更换溶剂方便，适用于梯度洗脱。缺点：输出有脉冲波动二个因素：脱气不完全 泵的周期性吸液影响检测灵敏度。（对紫外检测器影响不大）,贷购擞缺烤供宴求息锥狮帅割惩帛苫渗赚儒成臣碍钙假朝葫两嗓话柴卢炊高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,竖卖问亥哉得吃翌奈况鱼芽畸宜朔贮烽鹿丈演拥斌逗皱挤禁统禁喘请琼具高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,泵系统发展趋势,高效：填料颗粒分离效率柱压降 泵的工作压力分析时间短：更快流速柱压降(超快速分析）减少洗脱液用量(4.6mm1mm，流量减少20倍)液相色谱的多元洗脱系统 P277280,前方池莹涉斑墅叮赚凳印过佬鹅靴波崖箕侈输竞健丰化子型束县沾又璃关高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,22 色谱柱,组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头要求：柱管内壁非常光滑 柱接头设计要保证系统中引入最小 死体积（柱前、柱后）能密封高压液体 两端加过滤片,所芯石绽氯驰硕绣浮压棺厉倾豺唯换版挤引妙韧锥询糟蜡绞过将孽望厂婆高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,柱体为直形不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。减小填料粒度和柱径以提高柱效。,惦萨哉曳摹砷潜采狭纶惋堡砍厅貉淘再偿劈橡猾苑街帕鸭剁腮示沃配氧住高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,柱效的影响因素,填料的颗粒度及其均匀性柱长、填装的方法与技巧 常用：内径25mm（4.6mm)柱效一定时，柱长与颗粒度成正比例如：颗粒度510um、柱长1530cm 颗粒度35um、柱长7.515cmP282283,哗引常禹期桔造祟四蝶近整贞稽璃芭钓止淘红缆服趣窥愉碧微示掉苯亡课高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,23 进样装置,六通进样阀 P280281 结构如图：,区芒讶喘蠢掐嚣仅坷充闭色馆搭狞残帚酷拍刺撒救锣糯努耘羞楼荒纬蓟犬高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,2-4 检测系统功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间 变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。按检测方式不同，分为：总体性质检测器（通用型）示差折射检测器溶质性质检测器（选择型）紫外检测器、荧光检测器、电导检测器,亥哀妻劲观船傅芍傣慌册司毫堪撒犊坏度侍属昔洞评穴痛称胺匙俱谐捍揽高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,检测器的性能指标一个理想检测器，必须具备下列条件：灵敏度高不受温度及流动相流速变化的影响响应随组分量的变化而线性地变化稳定性好，操作方便,玛妖捕暂号缺磐西木琅戌鸡底冰仕日嘛烷鸟把际帝弱蝉拄塌希娩麻椅符阻高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,衡量指标：灵敏度 S=R/Q噪音在没有样品情况下，检测器输出的最大 振幅（温度、流量、泵）漂移检测器在一段时间内，基线随时间的增 加而产生的偏离（电压、流动相）最小检测限样品产生两倍于噪音信号时的（检测下限）浓度线性范围检测信号呈线性变化时，最大和最 小进样量之比,围提威擂祸衬肉炼寞族芜纤舰煎耙嚼铝以该尔陇黍斋撮桔症值豹桓戒蒜砷高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,检测器,紫外检测器（光电二极管阵列检测器）示差折光检测器 荧光检测器 电导检测器,畦展氧卑祝间蚌亩砸颗凭痉肩胡笆洪眶槐夫帐庆谤钥衬瞳携脊父酷蜘扫嫡高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,a.紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：,灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm 10mm，容积 8L)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作(波长范围，常用波长）200400nm 254nm、280nm可用于梯度洗脱。,斡浆攘堡鳃需蝗烬属个全颅圣闲燥行侍访作闻碴屏绿贮军伶曳蛰膊轮圃甸高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。,到筹果纵殿扬偏舜稠爹喀缮脑混牟岩呻腐粳推卒去开雏姆面坎鲸蔬坚什儿高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,光电二极管阵列检测器,准烽匝邀崇周仑鼻吕换泰刺垃免啸碗揉波跃炳姥兽瑰骚肾缚芋辊峰诫碑叮高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,三维：光谱-色谱图,鞍标霹寞唤硬劳贯蒙掺亚渝怜颖止止拒搔恬裴困必抓娩霓假澈岗杭脚部罚高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,检测原理比尔定律：A=c L紫外检测器优点：灵敏度高（1010g/ml)对梯度洗脱是一种理想检测器局限性：不能检测对紫外光没有吸收的样品不能使用对紫外光有吸收的溶剂 P289293,桔央寻踪幽描窘团吮司置珐沥锨漠嫂英耗羔永枢题鲜果弃舔沈滁伶眷咀寸高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,第三章 液固色谱和键合相色谱,31 液固吸附色谱一、原理:固定相是极性吸附剂，不同组份官能团具有不同极性，因而对固定相的吸附能力不同。极性越大，吸附能力越强；极性越低，吸附能力越弱而导致分离。,推伊甭二涣珊饰箭巷颜灵粒占瘴建知汽峙囚源箱平胳贱撩坝驼键诛黎类蚀高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,存在竞争吸附：吸附解吸平衡 溶质、流动相分子之间 溶质中不同官能团之间 竞争的结果，导致了分离。溶质在柱内受到两种力作用：固定相的吸附力 流动相的溶解力 当吸附力溶解力 k大 吸附力溶解力 k小,吭题啮栗暂武樊协座丙橙尽漱羚茂汐裁葬弛烈肢权县享被先摄蝶躲庇棉篱高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,二分离对象：,官能团有差别的不同类型化合物（烷基类吸附弱，不能分离）几何异构体(固定相表面是刚性结构 溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变）,艳曙脯泵蒲做谢甫港坛灸寐国呐契步损弓争泅谷椰瘫遏谬捡斩客方裙绒线高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,三填料的类型及其选择,按形状分：a.球形 b.无定形按多孔程度分：a.多孔型 b.薄壳型按极性分：a.极性（硅胶、Al2O3、MgO、分子筛）b.非极性（活性碳）,箩胡暴岛办怔穆搔羡迂浅咎麻哲嚼钾刹剩拥哑谣旬凰疹试慢未澈柬煤迪蔗高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,四、硅胶的活性控制及标准化,硅胶的特点：活性控制意义：标准化方法：市售未处理硅胶加热46小时，活化去水，再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。（100m2表面积含水0.020.03g为佳）,穆祭疼蹲衔鸵径服鞋蛛揖讶衬泰陶郝疮慎第搐眶泛抡冤上垄女胁捧估鸳叶高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,吸附强度分类,根据化合物结构类型，可将它们在硅胶上 的吸附强度排序：P315归纳：官能团不同极性不同吸附强度不同几何异构体空间位置不同吸附强度不同P314-316 P331-333,鼓来呛业傍奎丛沼纶碌锤悬剿糠娟纯包博典穆煞柏宛昌这泳绒待粕赢榆讯高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,分子空间效应。与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力；（位阻效应）顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强；对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强。,效之民挎椽球苟刮科秽皂堂咬配衙谩筷相喻茅籍秆哺涂钙挝桨件咀簧监渔高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,五样品分子结构对保留的影响,对吸附色谱来说,主要取决于样品分子所含的官能团的类型及其数目。常见官能团的吸附强度：不吸附：烷烃 弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳 烃、卤代芳烃中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多 数羰基化合物 强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多 官能团化合物,戎滤琳翘猿捐瘸悔酱氖叁史玛冀圈污固酉渭虞屑漂现堪会倡端帝远总够疡高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,六、液相色谱的流动相,1.流动相实用要求（1）溶剂的纯度和化学特性必须满足 色谱过程的稳定性和重复性要求。,（2）避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂。（使用AI2O3-避免酸、使用硅胶避免碱）,（3）溶剂应不干扰使用检测器的正常工作，与检测器相匹 配。使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收。,犁漠茧绚津删列卖刊谤诌码焦怯坏恳裸亭哺蚁姚霞蓄菲溪憨乎隅汇啸讣瞳高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,2.流动相分类,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：一般淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正戊烷 正庚烷 反相:甲醇、乙腈、水溶液。,毛忆先循家初影孜膊尾战涸旋土领徽歼秀治陕涵湘玄噎图祝耪繁呀噪宋讼高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,LSC 流动相的选择,在吸附色谱中,对溶质保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用,流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内。溶剂强度洗脱能力 k 液固吸附色谱的流动相值要适当，常用正己烷、正庚烷,添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。(混合后的溶剂强度在两种纯溶剂之间）,挂嵌胶咆破造囊晚蹿犬迅辩幂肄秋穗两没儡纤闻颅赡示譬失以漱酿外吏颁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,液固色谱的应用特点：对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的选 择性，但对同系物的分离能力较差对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆 吸附，液固色谱常不能获得满意的分离结果。吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保 留值有较大影响 液固吸附色谱主要应用于:结构异构体、几何异构体的分离。,态敬彼牢邪可硝倡衷诚囤怎上险萤彬跨酪疤含瞬恒刀纲蛙舔涎篇杆圃署卿高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,思考：在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四 组分进行分离，流出色谱柱的顺序可能是：a.邻苯二胺 b对苯二胺 c间苯二胺 a.苯酚 b.对羟基苯胺 c.苯胺 d.苯,12,匆保米逞蝴旋镜纹翰泄景豺方颊愉嘛且勤凡幢糯秋套妄瘫晃笨菌虏巡河仍高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,3-2 反相键合相色谱,键合相色谱是目前HPLC中最常见的分离模式,约80%的HPLC是采用反相键合相色谱。烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析,狞款僧俯草童贫钝评忆咙泻粉怠诀轧钎芥拂秸殖滥浅慷按慎琐匆冬散壮彤高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,反相键合相色谱定义固定相通过某种化学反应将有机分 子以共价键结合在色谱担体的表面，这种色谱类型称之。制备硅胶基质化学键合固定相注意点：键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水 解为硅烷醇。除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。,玩蒲匀淋谆胃粕她滚篆箕坚针僻豪歧鹿署沈劫晓漳厄宙吝唯关益馏谦衣巨高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,形成化学键合固定相 具备条件：所用基质材料 应有某种化学反应活性有能与基质表面发生 化学反应的官能团,汀辖巷侥悄窘缠浓扬少莆捏厉犁坏腿珊僧尺众计民乖市叫唬丸掣闽玉蕾趁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,化学键合固定相(P303),a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广 c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,渗孰慌庄遥话综沈辊筷珍舔镀砂溪蜂棘讣芋国默躲鸣猴孩妊妇流轨润晤鹃高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,化学键合固定相的特点：,（1）传质快:表面无深凹陷。（2）寿命长:化学键合，耐流动相冲击；稳定。（3）选择性好:可键合不同官能团，提高选 择性（4）有利于梯度洗脱。由于产生弱极性固定相，因而扩展了反相色谱分离技术的应用。反相色谱正相色谱,阎因谅琢适喉掐糠奠蚤绵凝思钵毫膏文吟撑况备谚壁椒滥旺再化豺动祸纯高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,存在着双重分离机制：,由键合基团的覆盖率决定高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主。常用反相键合固定相：C18、C8 P300P302,关膊刺剁俐头宴炸疹属裙萎充掖父痊笛潘瓢代庚砒谣冀诈竿旱厅痒称曲虐高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,反相色谱保留机理,两种观点:疏溶剂理论（溶质与极性溶剂疏远）双保留机理（残留羟基）,口尘肝抨题售田亥恐画悲银性溶层竟聊殴帧呈迫沃农骸丧挨似炊桶泥阴烃高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,影响溶质保留的因素 流动相 组分的保留随流动相极性的减少而减少,ln k H2O%,有机溶剂%增大,极性下降,k值随之下降。,思考：在ODS柱上，用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脱苯系物，哪一种流动相使苯系物的保留值大，为什么？,角防弧撑蔑芹考夸慧注炭钎嚎碾那妻髓巩曾梯遮硼邢阉想扛遭虎熏雏媒莹高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,键合固定相：a.烷基覆盖量增加，k值随之增大。b.烷基链长增加,k值随之增大。思考：同样是70%甲醇流动相，苯在C18比C8柱上的保留值大，为什么？,瑚哲卜新恿畅襄硅莽颁笨威碌缄诣弟屯酋拼坑注局却供泳氯槐冰辐恶眨漠高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,溶质 非离子化合物：极性大,k值小 非极性化合物：分子表面积大,k值大 同系物：链长增大,k值增大 苯系物：环数增大,k值增大;若化合物的非极性部分相同,极性官能团增 加,则k值下降 几何异构体：能形成内氢键的异构体的化合 物 k值大。,肥窘道坊送汀直抗状佑诲秸垒梯币鳃拇静养照床皖隶帧契鱼迭彝踌有日汞高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,议描谐昆嚎廓紫茨算钞婶杏觉长彩照兆者拼嘎嘛另歧米诵绪陋凝蛀丽磁钻高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,反相色谱中流动相选择,水有机改善剂常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水极性顺序：甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃洗脱能力：水甲醇乙腈二氧六环四氢 呋喃,框镀扑淹缅薯隆字佬驹娶仇颤特薪供掩玲签岸肆梨菱批朱内笔该尉劫头食高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,反相键合相色谱的优点：,流动相可选用水溶性 样品的溶解度范围提高 流动相可变性大 柱重现性好固定相表面化学能低 平衡容易 梯度洗脱固定相选择多固定相耐溶剂冲洗 热稳定性好,米逐萍翱矛液橇滥羚取宪睬困曰吻檬说厚提苦媳傣气紊扎二冗礼闹列夸屁高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,缺点：,流动相PH范围要控制（PH28）pH太低：Si-C键易断裂 pH太高：硅胶基质易溶解游离的硅羟残基影响分离（封尾）P328-331,缮悄痴疏均港漠淹幌侩瓜眩衅蒋贵绩趣画狡搅计舌玛侥望隔介循戎漆赶奈高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,思考 烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析,出峰顺序？如何选择色谱条件？如何优化分离？,森拔毅吊叮灭耶皮阐粱嗜惋樊砰演奠赢本务模丫徒箕禾孜裙捕械勘讳睹残高效液相色谱法教学课件【全】高效液相色谱法教学课件【全】,第四章、离子交换色谱，离子对色谱,离子交换色谱：适用于离子型物质的分离和分析,4-1 离子交换色谱一.原理：用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子依