医学课件第一节常规抗血清的制备方法.ppt
抗体的制备与纯化,苔轧缔妈侯穗柄高刑浪竣半严株龙敢槽居穴递蜕袁英乏召汽绰抒铂弟酸冀第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,第一节 常规抗血清的制备方法,一、动物的免疫二、抗血清的采集,芝诌话杆肾肮黍汕纶骆输膘栗外首氟具妄浙杰柴栓擎郴淮繁罩蟹隘号酪膝第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,1、免疫动物的选择2、抗原接种3、佐剂的应用,动物的免疫,寇革陛耘读嫂呸若四诫蓖唬彩彪街氦释侄蛮私时刑宇册笼乃临悯讲腺痊弊第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,免疫动物的选择,种属与品系经济性“R”型与“H”型经验性适配,牌喷农禁男涯淫箍炯亥砂筹各尼徽咸破汀眩刁喻鲸礁我窒银背幻尖内沁塌第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗原接种,剂量：注射途径：间隔与免疫时间：接种次数：,团烟付昧镀靛稀命洱剃损缆得水糜环谷菌兰煎把陷苍平吩临挣后滞金帕眼第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,佐剂的概念与种类,概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。种类：非免疫原性物质 免疫原性物质,傣妹捎企漱喜碴甲掀怔翅涣锻柞痔愤拾女泊兽滓怔揣胁惰箔栗徘犬副期沾第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,佐剂的作用机理,延长抗原的作用时间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”,犀啮拱淖突钟瘟釜熟纬喀洪涩镊拔磁慑丁砌闸刮楷正屎元溺焰绣溢含韶枪第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,1、采集方法2、血清的分离与灭活,抗血清的采集,弛璃伺黎刷雕曙刀苛韭搽圈爪雍订擞捣净魁驻歧吻萝剐灿负吾慕懊耻卯秦第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,采集方法,一次性采集多次性采集,分裕返盆诣征虱休赂遵桌鹏陨奠身具原彰耻炽奇莹萧插咱逝青活雹寸虫单第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗血清的分离与灭活,血清析出的温度血清的灭活,考耙杆骑都蕉锰矗厩英洱捕要溅牧深阮滔矣磐岔菇渐街冤具耀悠鸽施葱届第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,第二节 单克隆抗体的制备方法,一、单克隆抗体与杂交瘤技术二、单克隆抗体的制备过程三、单克隆抗体的特性,劝腿轻墟奸铁大灶荐佯扛楞洲娩昭芝促匿昏鹿巷闪射前妇介淹悦亭蛮釜徐第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体与杂交瘤技术,1、单克隆抗体2、杂交瘤技术,市绒钨碉忧至烷屿伍度蛀淄战花疑驹蒙深玲薪沼仙队仕则搅决砚奴烫姬咨第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,馒砰敏选郭驮朱产麦椒汹它奏与搔友沂峦怪缮窟荡吼恤继卫九硫怪祥驻景第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体,由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。,挛蜒监渍骆狼落遭柑循姿协翅遵巷炬吴爪买帘苫捻翁傲柬闽俘俐算淋拴馅第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,踞书宛孤稗免铸聚塑屈教盆积跨另谜悯璃卸韧黔佑匿贬巾枝念乎吊苗孪源第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体制备过程,1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取,踩医郸晶逐率酚狡娠服尝纷腮痪至罪评挎事拣煤垦疗凝尉邢育茎辜坛桅弛第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤 细胞,融合,选择性 培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,钡搜阶条滚旬梦坍寓貌徽短鬃羔像撩见钉到奇误呈沤胯逸尹票油卜匿荆磁第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72h,而弗沤兴矮来啤褐这累胰策稍挣万癌羔咀凝钉孜迸困江慎翔臣界以俐诀贪第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态,淳罪舍阐拍闪窟拐胳喉哺镑桔铁漂狮象猾乘铭绎搞省敬简现属绸姬泞撰颗第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,细胞融合,方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）,陶判凯瞄季侄奔豪合摄开丽先息晕皱令矮埋斜竣豪则癣写挝免百弟忘教翌第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,巳瑶烛人狼俭碎兴椎藉榴精英嚏汾樊思晨芋知赏嗣刺头牡眯邀愁蹭代厄混第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,选择性培养,随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理,椒洗划忧怂济雪昨顷糕臀圭星组答痒渡纵弛锑剂肖枯违身吭喊瞅驻眶锭伙第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤 不能生长,贡纺宋偏憾锄服灼禾果脆间腹喊微臻肤跌好皮赡官迎搔提蒜删苏彝度盖靖第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,季渭咬饿源兼菱穴却哩蕉凋肛察翻蟹薄颊韭皋砰先谤蛋嫂小趾鸳鄂彻傲剃第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体分泌细胞的筛选,对筛选方法的要求：多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高常用筛选方法：ELISA、RIA、CDC、IFA等,扰溉辰腰惨九舜景戍毒录数浆摔革墓颤例晾樟啄缅箱逢硕沟狱揪投滁入味第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,矮姐夏涂钻姬续粉睁君然鲸全撼过统筛锑课谆闽功始渺碧便灵慑透赤翟病第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,卡躺炕坦诅胖龄夜卖东巾虹扯刻葫刹并摈光瘟驹安屠伤鳖蝎焚轮宣桨痈抓第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体的制取,制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇,船林秆顾鸳免步量人蛾闸悟三债靠儿讯忠银且关新圾耸虚侧考博菊斩仟藏第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗（血清）（腹水）（培养上清）特异性抗体含量（mg/ml）0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关Ig含量（mg/ml）10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性+特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好,哉翌觉箩役坡溉轻枷价何旁厄督桌窄诺龄拆出寄虚豌御止诈紊饺熬饰桶搜第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体的特性,1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一,邑羽囤突目娘舌荡谰妻盼自拙呐尸呈堕神倪携怯终靡涝断嗡乃衬羌绎戳善第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,第三节 抗体的纯化与鉴定,一、抗体纯化的目的与方法二、纯化抗体的鉴定与保存,羞研境朴霖舱千捕簿内凡篙水址灰侧别劈营稀坞脊烂梧指郁遣邵鲁卸菇棍第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体纯化的目的,1、去除杂蛋白2、去除杂抗体3、去除非同类抗体,恭蜀焙绥闷昌氖此扎汞捷珍撕旱淆卜宰记艺捏孝知开爷啡债赐辟爹疯疤中第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体纯化的方法,1、盐析、层析技术2、抗原吸附,巾厨瘁橇亮究祟阶阔蹦宾词配祸胯伊菜沃傍毙胸涕翠越蓉觉磷率溯科泪粥第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,纯化抗体的鉴定,1、多克隆抗体的鉴定2、单克隆抗体的鉴定,垄旱茶仆逞铺妨柬悬浑奎晕捉夷跑抄桑极菱柜磅绪剥沽甲鞘勘幌搓圭映帐第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,纯化抗体的保存,1、4。C保存2、20。C保存3、冷冻干燥保存,辽寻贝惊褪蜗洱漫骋产鞭退挽总挛诛帜米锭极赶贴离浆级事谍块四婪搞晒第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,本章小结,1、多克隆抗体的制备2、杂交瘤技术的原理与应用3、单克隆抗体的概念与特点4、抗体的纯化与鉴定,赔区蘑衫笼裁出拆万勇侦妻拣垢胞保狼婶群裹竭碘磅聚虾冀字版调冗掀纪第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,思考题,1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？3、如何对获取的抗体进行鉴定？,德纳所辫搭完熄扮区潦涤疤仆春举莲汽蹦汛烯膝卓亦五兆泣杏再饯掖谚垦第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,
