2022染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用（全文）.docx

2022染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用(全文)染色体微阵列分析(chromosomemicroarrayana1.ysis,CMA)技术是一种高分辨率、高通量检测人类基因组DNA拷贝数变异(copynumbervariant,CNV)的分子核型分析技术。CNV是指长度1kb的DNA片段1,约15%的人类遗传病由基因组CNV引起2。近年来，CMA技术在产前诊断领域中的应用越来越广泛，很多研究证明了该技术具有传统染色体核型分析所无法比拟的优势。CMA技术对染色体非整倍体和不平衡染色体重组的检出率与传统染色体核型分析相同，且分辨率和敏感度更高。更为重要的是，CMA技术能检出染色体核型分析技术检测不到的基因组微缺失或微重复变异。一、CMA技术在产前诊断中的应用概况CMA技术在产前诊断中的应用，尤其是作为临床产前分子诊断的依据以及如何规范执行，能否完全取代染色体核型分析，一直备受关注。近年来，多项大样本(1000例以上X多中心的研究结果为CMA技术应用于临床产前诊断提供了科学依据3-8,见表Io对于所有介入，性产前诊断样本，CMA技术对染色体异常的检出率为1.8%17.5%3-8;其中超声提示胎儿结构异常、高龄和血清学阳性者，CMA技术对染色体异常的检出率分别为6.5%27.4%、0.3%3.0%和0.0%10.3%4,6-8o染色体核型分析结果未发现异常的产前诊断样本中,CMA技术对染色体异常的额外检出率为0.8%5.5%4-8;其中超声提示胎儿结构异常、高龄和血清学阳性者，CMA技术对染色体异常的额外检出率分别为6.0%9.0%、O0%1.7%和0.0%1.6%4-6,8.2013年Hi1.1.man等9的meta分析共涉及25篇文献共18113例个体，结果显示，在染色体核型分析未发现异常的病例中，CMA技术对基因组不平衡重组的额外检出率为0.4%50%（变异范围较大的原因主要为样本量、样本选择标准及芯片平台存在差异），临床意义不明确的CNV（variantsofunknownsignificance,VOUS）比例为1.4%;而在CMA检测结果未发现异常的病例中，染色体核型分析的额外检出率为0.6%,其中绝大部分为染色体平衡易位或倒位。超声提示胎儿结构异常且核型正常的病例中，CMA技术的额外检出率为10%,VOUS比例为2.1%;而超声提示胎儿结构异常且CMA检测正常的病例中，染色体核型分析的额外检出率为08%,其中绝大部分为染色体平衡重组。提示CMA技术可以作为临床产前诊断常规检测的TP分，对于所有介入性产前诊断，特别是超声提示胎儿结构异常者，应用CMA技术可明显提高有临床意义的CNV检出率。二、CMA技术的芯片平台选择根据探针类型不同，CMA可分为2大类芯片平台，一种是基于微阵列的比较基因组杂交（array-basedcomparativegenomichybridization,aCGH)技术，另一种是单核甘酸多态性微阵列(sing1.enuc1.eotidepo1.ymorphismarray,SNParray)技术。这2类芯片均可检测DNA不平衡CNVoaCGH技术使用的CNV探针较长，其优势在于用户可根据需要设计并制作芯片，可针对特定区域设计高密度探针，以增加在该区域的检测灵敏度和特异性。SNP芯片除了带有拷贝数信息外，还带有SNP分型的信息，因此可以检测杂合性缺失(1.ossofheterozygous,1.OH),从而用于检测单亲二倍体(uniparenta1.disomy,UPD)、低水平嵌合体(mosaic近亲婚配及三倍体。目前，CMA技术已将CNV探针和SNP探针整合于一体，取长补短。根据探针分布范围不同，CMA技术采用的芯片还可分为全基因组微阵列芯片和靶向微阵列芯片。全基因组微阵列芯片的探针在整个基因组基本均匀覆盖,因此检测到VOUS的可能性较大,给结果分析和解释带来了挑战,优势则是可以发现未知的CNVo靶向微阵列芯片主要靶向已明确的遗传微缺失和微重复综合征相关区域，以及在线人类孟德尔遗传(On1.ineMende1.ianInheritanceinMan,OMIM)数据库确认的致病基因所在区域，并增加探针密度；同时包含全基因组的骨架区域，减少已知良性CNV区域的探针密度，对产前诊断的结果解释以及发现疑似未知的CNV非常有利。以上芯片在细节上各有侧重点，也各有优势，无论选择哪种芯片应用于产前诊断，都需做好充分的患者知情同意及检测前后的遗传咨询。二、CMA技术应用于产前诊断的临床应用指征参考加拿大医学遗传学会(CanadianCo1.1.egeofMedica1.Geneticists,CCMG美国妇产科医师学院(AmericanCo1.1.egeOfObstetriciansandGyneco1.ogists,ACOG)及母胎医学会(SocietyforMaterna1.-Feta1.Medicine,SMFM)发布的指南10-11,CMA技术在产前诊断中的临床适应证如下。1.产前超声或MRI检查提示胎儿结构异常：推荐CMA技术替代染色体核型分析作为一线检测方法。2 .胎儿染色体核型分析显示为遗传自亲代的或新发的染色体平衡重组：推荐CMA技术作为一线检测方法。3 .胎儿染色体核型分析无法明确诊断的染色体畸变：推荐CMA技术作为一线检测方法。这种情况包括衍生染色体、标记染色体等，通过CMA检测可帮助明确异常片段的来源和性质。4 .无结构异常而行产前诊断的胎儿样本:CMA技术和染色体核型分析可以任选其一。这种情况包括孕妇高龄、血清学筛查阳性、孕妇焦虑、不良生育史、染色体异常家族史、超声软指标阳性等。5 .胎死宫内及死产胎儿:推荐采用CMA技术检测胎儿组织样本(如羊水、胎盘和流产物)以提高检出率。三、CMA技术检测前后的遗传咨询及结果解释CMA技术在临床的开展与推广，对产前遗传咨询工作者提出了更高的专业要求。开展CMA技术的科室应当由临床遗传学、分子遗传学、细胞遗传学、生物信息学等多学科的专业人员组成，检测结果与临床资料应实现有效衔接，实验室之间以及实验室与临床医生之间应保持良好的沟通，从而保证为患者提供充分全面的检测前及检测后遗传咨询。(-)检测前咨询及知情同意在进行产前CMA技术检测前，应该由经过专业培训及具备相应资质的临床遗传医师对孕妇及家属进行检测前的遗传咨询，充分告知CMA技术的优势、局限性和可能的结果等，并让孕妇知情同意。检测前咨询及孕妇知情同意的内容应包括以下几点。1.CMA技术的优势：能够检出所有引起基因组不平衡改变的染色体异常，包括所有核型分析能够检出的染色体不平衡变异，以及核型分析无法检出的染色体微缺失与微重复。2 .CMA技术的局限性:(1)无法检测平衡染色体重组(在所有产前诊断样本中，漏诊率约为0.6%9极低比例嵌合体（10%）12、某些标记染色体、单基因突变及DNA甲基化异常。aCGH芯片还无法检测三倍体。（2）可能会发现VOUS,这时可能需要对父母样本进行检测，通过家系综合分析，以协助对胎儿检测结果的判读。但在很多情况下，基于目前对人类基因组的认识和数据库的积累程度，仍然无法对某些检测结果进行精确判读和解释。3 .检出疾病的遗传异质性：所检出的某些遗传性疾病由于外显率和表现度的差异，在不同患者间临床表现可能存在很大的变异13-14。4 .可能检出与临床表型不相关的CNV:通过CMA技术检测可能发现非亲生父亲、近亲婚配、迟发性的遗传病或成人期发病的遗传病（如肿瘤），这些结果应该让孕妇及家属选择是否被告知。（二）检测报告及结果解释CMA技术检测的临床报告至少应包括以下几方面内容。1.所使用CMA技术平台的检测内容及局限性。2 .所使用的芯片类型，包括芯片的名称、探针数目、分辨率等。3 .根据目前国际细胞遗传学命名体系,实验室报告的CNV应包括以下要素：（1）细胞遗传学位置（染色体数目和细胞遗传学区带定位）和线，性坐标（起始及终止位置（2）CNV的拷贝数及变异类型（如缺失、重复、1.OH1.（3）CNV片段的大小。4 .报告中应明确阐明每个CNV的性质，并提供支持这种解释的证据及适当的参考。按照美国医学遗传学会（AmeriCanCo1.1.egeofMedica1.GeneticsandGenomics,ACMG）的指南15,根据临床意义不同CNV可分为3大类：致病性CNV,非致病性CNV（即多态）和VOUS（又可分为可能良性、可能致病和不明确5 .对检测结果进行解释。在临床实践中，常规作法是参考国际公共数据库基因组变异数据库（DatabaseofGenomicVariants,DGV国际标准细胞基因组微阵列（Internationa1.StandardCytogenomicArrayJSCA数据来源于Ensemb1.e的染色体不平衡和表型数据库（DatabaseofChromosoma1.Imba1.anceandPhenotypeinHumansusingEnsemb1.Resources,DECIPHER）.OM1.M等、同行比对数据库、实验室内部数据库及检索最新文献信息（PubMed）对所检出的CNV进行注释。对于有明确临床意义的CNV,可以直接报告对应的遗传综合征或临床上最相关的致病基因。对于VOUS,建议检测父母是否为携带者，是排除家族性良性CNV的最好办法。（三）检测后咨询及临床处理出具临床基因芯片诊断报告及检测后咨询的人员，应该是通过专业培训及具备相应资质认证的专业人员。针对不同的临床报告结果，应有对应的、具体的临床处理方式和流程。由于基因芯片报告结果解读的复杂性以及不同实验平台的差别，同时还需综合考虑临床相关性，以及社会、伦理和法律责任。1.非致病性CNV:基本可以排除由基因组不平衡改变而导致的遗传病，但必须向患者说明CMA技术不能检测所有的遗传病，如极低比例嵌合体(<10%平衡染色体重组、单基因突变等。2 .致病性CNV:(1)胎J”佥出明确致病性染色体微缺失或微重复综合征：若其父母有再次妊娠计划，应建议父母行CMA检测以明确胎儿致病性片段是新发突变还是遗传自父母，以对再次生育作遗传风险评估。(2)胎儿同时检出缺失和重复：胎儿的缺失和重复可能来源于亲代的染色体平衡易位片段的不平衡分离，若其父母有再次妊娠计划，应对父母样本进行荧光原位杂交(f1.uorescenceinsituhybridization,FISH)或染色体核型分析以排除染色体相互易位或倒位，并对再发风险进行评估。3 .VOUS:应建议父母行CMA检测，通过家系综合分析以协助对胎儿检测结果的判断。(1)新发CNV:当CNV被确认为新发突变，尤其是有证据表明该区域内有疾病表型相关的功能基因，通常认为是可能致病性；若该CNV区域内没有基因，通常认为是可能良性。由于基因组的许多区域都存在一定的突变率，确实有些CNV可能是新发突变，但还未发现其临床意义。若只有单亲样本行CMA检测目在该单亲样本中未发现类似CNV,则对该CNV无法做出临床意义的推断。（2）遗传性CNV:若胎儿父母有临床表型，同时该区域内有疾病表型相关的功能基因，通常认为该CNV为可能致病性。若胎儿父母无临床表型，通常情况下，可判断该CNV为家族性良性CNV;若胎儿CNV与亲代CNV大小不同，且缺失或重复的范围扩大了，则应考虑为可能致病性。此外，在某些情况下（如多个家系有类似文献报道），还需考虑不完全外显、临床表型差异（父母可能有亚临床表现）的可能。五、CMA技术相关的临床应用指南自CMA技术开始从产后走向"产前，其临床应用价值得到了广泛肯定。为了规范CMA技术在产前诊断中的应用，每年均有国际组织和机构发布临床应用指南。随着CMA技术的发展进步和在产前诊断中日益广泛地应用，以及大样本量、大规模应用研究结果的发表，相关应用指南也在不断与时俱进，完成了从辅助诊断工具到一线检测方法的转变。下面对相关指南作一简介。1. 2009年ACOG指南16:（1）染色体核型分析仍是产前诊断中主要的细胞遗传学工具。（2）靶向aCGH可以作为结构异常而染色体核型正常胎儿的辅助诊断工具。（3）对先天异常死胎而未能获得染色体核型结果的病例,aCGH可以作为辅助诊断工具。（4）夫妇在产前检测前必须进行有效的遗传咨询。（5）靶向aCGH是一种很有用的遗传病筛查工具，但需要进一步了解其优势和局限性。2. 2010年CCMG指南(http:/www.ccmg-ccgm.org):以下指征推荐将CMA技术作为一线产前诊断方法:(1)产前超声或MRI检查提示胎儿结构异常。(2)具有遗传自亲代的染色体平衡重组，且该胎儿先天性发育异常。(3)胎儿G显带核型分析显示为新发的、平衡的染色体重组。3. 2011年CCMG指南10:(1)在发生染色体结构异常低风险的妊娠中不建议使用CMA技术，如：孕妇高龄、血清学筛查阳性、曾生育非整倍体儿及产前超声软指标阳性。(2)推荐将CMA技术用于超声或者MRI提示结构异常的胎儿，并且该胎儿快速非整倍体筛查结果为阴性，在保证合适检测周期的情况下可以取代核型分析。4. 2011年ACMG指南15,17:(1)强调临床应用CMA技术的具体要求：应高密度、覆盖全基因组，对400kb以上的CNV检出率99%且假阳性率1%。(2)为帮助临床实验室对芯片结果的解读保持一致性，制定了CNV结果解读指南。5. 2012年欧洲细胞遗传学协会(EuropeanCytogeneticistsAssociation,ECA)指南(http:/www.e-c-a.eu/EN/):强调CMA技术临床应用的规范化：(1)aCGH及SNParray技术均可用于临床诊断,在报告中需注明探针数及分辨率。(2)CMA技术可作为染色体核型分析和FISH的辅助诊断技术,也可作为检测染色体异常的首选方法。(3)强调实验室检测的质控要求，报告发放规范化，结果解释应详细全面。(4)对既有缺失又有重复的患者，其缺失或重复可能来源于亲代的平衡易位片段的不平衡分离，若其父母有再次妊娠计划，应对亲代样本进行FISH或染色体核型分析，以排除染色体相互易位或倒位，并对再发风险进行评估。6. 2013年ACOG和SMFM指南11:（1）对超声提示胎儿结构异常，推荐CMA技术替代染色体核型分析作为一线检测方法。（2）对无结构异常而行产前诊断的胎儿,CMA技术和染色体核型分析可以任选其一。（3）CMA技术适用于任何年龄阶段的孕妇，CMA发现的大部分染色体异常与孕妇年龄无关，因此不局限于35岁或以上孕妇。（4）对胎死宫内及死产胎儿需进行细胞遗传学分析者推荐采用CMA技术检测胎儿组织样本（如羊水、胎盘和流产物）以提高检出率。（5）CMA技术应用于评估妊娠早、中期胎儿丢失病因的研究数据积累不足，暂不推荐使用。（6）CMA技术检测前和检测后的遗传咨询非常必要，遗传咨询内容需要包括CMA技术的优势、局限性和可能的结果。CMA检测需要孕妇及家属签署知情同意书，并且需要告知CMA检测可能涉及发现VoUS、非亲生父亲、近亲以及成人期发病的遗传性疾病。六、CMA技术在产前诊断中的应用前景CMA技术的应用极大提高了对已知疾病的检测水平，以及对未知染色体微缺失或微重复综合征的发现，促进了临床诊断和遗传咨询水平的提高。由于CNV在人类基因组中的分布非常广泛约占基因组序列的12%18,使得在临床应用中对CNV性质的判断和临床意义的解释面临许多困惑。CMA检测中发现的VOUS一直是争论的焦点，这主要是由于目前对这些变异的研究较少，在临床上还不能确定这些变异与表型之间的相关性或者证据不足，但这不应该成为阻碍CMA技术临床应用的主要因素。通过数据的长期累积，建立和不断完善CNV相关数据库(包括国际公共数据库及各实验室内部数据)，将促进明确和规范CMA结果的解释及遗传咨询。研究数据已表明，新T弋测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术可用于检测单基因突变、基因组不平衡重组以及平衡重组19。最新的研究还表明，应用NGS技术不仅可以无创产前筛查染色体非整倍体，同时还可以检测不平衡的染色体异常，包括微缺失与微重复20-22。在未来的产前诊断中，CMA技术有可能会被正在蓬勃发展的NGS技术所取代，然而与此同时，临床不明确结果的检出率也!各会大大增加。新技术在产前诊断中的应用有赖于相应生物信息学和遗传学数据库的发展，以及遗传咨询医师对基因组学和生物信息学知识的掌握。