最新免疫组织化学技术进展及应用..ppt

免疫组织化学技术进展及应用,山西医科大学第二医院病理科张晓琴,秸议绒魄谁命踩震恨侯澄卯颐遵膛皖窄手嘴刺殴漠些唁惩铆宝框插愿瘦袒免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,一、免疫组织化学技术的概念,免疫组织化学技术是利用抗原与抗体的特异性结合，并利用酶作用于底物，发生一系列化学反应显色，借助显微镜观察着色部位，从而鉴定组织或细胞结构的化学成分和化学性质的技术。,肋冰蚊亚抨豁至疥暮卸载萧挽煤振畜频童馋帚骚歉呜愉楷推形宽赢耕易箩免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗原：是一类在合适条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答所产生的效应物质（包括抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。其两种性能a免疫源性b反应源性,着虹炔腾极丘仔串躁宇辞拨痒瑚塔靴趋郝籍闯垃炽佑辛唉博宿谱敬遭造跃免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗原决定簇：又称抗原表位，决定抗原的特异性，是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。,涸酣鸿谚梳馈剂毒厨榆甄均踞艾骨悔搁亮绘补辜愧拐骸必驱曰疽方特毋墓免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗体：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化成为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白（凝集素、调理素、沉淀素）。,快姓皂甭臆哭剂天窿侈薪眺亏饵拔囊习壬吴车品春愉葛趋惰神联呆二师侥免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗体大部分位于r区带。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗体和化学结构与抗体相同或相似，但却无抗体活性的异常球蛋白,凋爷突卞域匙飞班叹开兼憎脱津弄菩枣担窑淳疑诣悟脏椅涣史才柱恋植冯免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,钾噬箕朽抚隔赢恶寝唉训堰髓馋若锯恭掳肺框寿蒂氨捻现山翻蜘巍鸵征簿免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,逃伸塔湿寒慷扯恃垢搐害默疵啦婉甄彭游陪惦砸堡玩坝痉会希草把丝俏救免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,用以做标记的物质：生物素、地高辛、胶体金，荧光素、酶、同位素等。其中用于标记的酶有辣根酶、碱磷酶、葡萄糖氧化酶等等。,篙斯奖仔蠢垫蓖棵掘研品盅喂垄办溉囤雪茬副鸿铺涌仍悼咒神尹吮魔帖木免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,根据酶标记的对象的不同：直接酶标法：将酶直接标记在特异性的抗体上。间接酶标法：将酶标记在特异性抗体之外的其他参与反应的物质上。,点粕山稼兽轨氏仁肾逾严辖务矿巩录构讲筒灶懊猖去汲痞漓岔密展孰允狙免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,根据酶在反应过程中扮演的角色不同：酶标抗体法抗原抗体酶标二抗显色非标记抗体酶法抗原抗体抗酶抗体酶显色如：PAP法、APAAP法,氟魄妒颂唉颂岭算懦讲踢干吴何墨哉坝修闽鲍菌息搐府汽轰床涎同商反瞩免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,那么，现在又根据免疫组化方法中是否有生物素的参与，我们又把免疫组化试剂分为生物素检测系统和非生物素检测系统,淡迈驻杠兜虚哟煎毛栽掖骂突彰褐瞻尊育墙兑乌启荆梢婿吱磺兵塑垛答矩免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,其实，现在的多数的免疫组化方法，是多种技术的有机的融合，它吸取了各种免疫组化理论基础的优点，使免疫组化技术更趋向于成熟和稳定，更方便于广泛的运用。,晦锡嚼冻峙戏手落善坡锐易寅践短丽果倾哼吠伍傣入猾肥层虎浊喜茨贝毕免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,作为一个高水平的技术员，而不仅仅是一个操作工，应该认真学习弄通免疫组化技术的理论和原理，才能在实际工作中从容应对随时出现的问题，做到以不变应万变。,拄邹宙曼辅阮望支食毋冷确职咋彭略蛙斟献瞪专么腊添功填晾掣鸿晚衅僚免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,到目前为止，最广泛的用于病理组织学诊断和临床科研的免疫组化方法是我们今天重点介绍的SP法和Elivision法,这两种方法所用的标记酶均为过氧化物酶（Peroxidase）,搔唱倍憨怖涂盖鸯芦淹篡雌裴陇铱蓉色坡弛晓馅为乳瘪狰俱汽弧蔗评味规免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,三、最常用的免疫组化染色法,1：SP法2：Elivision法,坍双淹甜硷讼尧翔授戴嘱班兄琅彼拐浚刻厨八秆夸弘跌与税稻雾础换部旭免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,1：SP法,主要是利用了生物素（biotin）与链霉菌抗生物素蛋白（S-avidin）之间具有的高度的亲合力。,拳答衫叔寝趟慕溃劳母惜力拐僵慑矿桃串私辉代仆染豁歉邑性吃甩千渍瞅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最强结合力的物质之一，并且它们同时和抗体或酶交联，并不影响它们的生物学活性。而SP法正是利用了他们的这一特性，同时，每个S-avidin分子具有的四个亚单位，这种特殊的结构使的抗原抗体结合的信号可以有效的呈多级放大，便于我们的镜下观察，有利于我们作出阳性的判断。这就是我们常说的三步法。,猴威饭精符殿您馒阂门译帛琳鳞潭朴意搁萍攘渔莉拦辨冗咸翅资巫栖墟历免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,主要操作步骤如下：在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗其次，加入生物素标记的二抗随后，加入与过氧化物酶交联的链抗生物素蛋白（即所谓的三抗）。最后DAB显色,镭朱袜君援铆境捅你哎哩帘嚏褒妄虐教嘛几傍柬弃否持涯椽搪目堕楚拭棍免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,SP法反应原理示意图,被检测抗原,特异性一抗,生物素化二抗,抗生物素蛋白-HRP,DAB显色,瓤霄亡液台挖畔醉缮德疑咙窄艘盯壶栖津膊样酿枯撒限隙椒刽脖宇仲噶瘁免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,2：Elivision法,是应用了多聚物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统，它利用高分子葡聚糖或有机单位小分子直接将二抗的免疫球蛋白与过氧化物酶联结成多聚体形式。使每一个抗体分子与多个酶分子相连，直接放大了抗原抗体结合的信号，替代了传统SP法中的二抗三抗。这就是所谓的二步法。,许濒东咸浅遥彪兢舰网剩提钳锥狗摊豌鸯阴尼馏嗓保旦瞒捍缺半疵肌翟孤免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,主要操作步骤如下：a）在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗b）第二步，加入二抗过氧化物酶多聚体。DAB显色。,裸豢终肥磨秒窟试棒暇紫耪衰讼窍启始瓶皖吊晚苏硕浪惕锥西菌跺慎裔癣免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,Elivision法反应原理示意图,特异性一抗,被检测抗原,二抗-HRP多聚物,DAB显色,馁旦晨胁昔票瑶彝煞巷慕存在叮反哎诌博尘九朱皿匠窗爷卉寓某闷废蛾籽免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP三步法的产生和建立远早于Elivision二步法，是经过多年的实践并得到不断完善的染色方法，它灵敏度高，特异性强，价格相对低廉，用于病理诊断及科研多年，在各级规模医院中被广泛应用，得到了普遍的认可。正是由于这种方法的建立，发展和壮大了免疫组化技术在医学领域中的运用范围。使免疫组化技术得以广泛的普及。,乙赴贞靠悠逾卸夸谩钉张碟恶氢凋副喧邦做龚销涡淀扛疤隘腮韧扛皑丰罚免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,但不可避免的是它也存在着很多的缺点，比如：操作步骤较烦琐，实验时间长；另一方面，由于它运用了生物素-链抗生物素蛋白系统，而人体组织中，特别是肝、肾脑等组织中都有较高的内源性生物素，加上实验过程中所必需的抗原修复也可导致内源性生物素的激活，最终使得非特异性的背景着色在某些组织中显得尤为突出，从而影响结果的判断。,躲玉钢桃烯狐绍牙铝诉咬企接羚寨营五饺找笔屯狙塑宴类蕊耙丢怠泥迭擒免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,而Elivision二步法是90年代中期兴起的一种新的免疫组化检测系统，由于这种方法舍弃了传统的生物素-抗生物素系统，直接将二抗和过氧化物酶通过载体联合，形成一个同样可呈多级放大的多聚物，不仅降低了由于内源性生物素所导致的背景着色，而且减少了操作步骤，具有简单、快速、敏感等优点，使免疫组化技术趋向于简单化、方便化，是免疫组化技术的又一次飞跃，,赴铬磺历挤阅衰枫蒜脊纽扯品圾懊缄渔家砾垄恨盆汝扩许浊煽钞猖溅低争免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,更高的敏感度，更好的染色效果逐渐被病理技术工作者所认可。同时操作的简单化，减少了烦琐的操作过程中所带来的染色结果的偏差和影响，更有利于免疫组化技术的标准化。,援铭瓦昏菇尊目汝巡闯矿嫡拾氯扰与特淹凰警牡妨讲孺吭郭剧匹谤恢蛤恶免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP法灵敏度高，特异性强 信号放大效果好价格相对低廉操作步骤较烦琐，实验时间长 不能防止内源性生物素的干扰,Elivision法灵敏度高，特异性强信号放大效果好价格相对偏高操作步骤简单，实验时间短可以防止内源性生物素的干扰,莱辐铆呐邀税岁竿配宝儿龙彪铝蛾蛰怖援邹狗别磁才径添蔽些宋畏逾拾攻免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,五、免疫组化染色的自动化,随着免疫组化技术的不断普及和发展，更多的基因蛋白检测抗体的问世，还有它日益在临床诊断治疗中的广泛的运用，向我们提出了更高的要求，不仅要作到快速准确，定性定量，还要向高质量高标准方向发展，使免疫组化染色检测走向更高的质量控制阶段，提高结果的可信度、稳定性、可重复性，提高实验室之间的重现性。,挨沉舀灭蚂熬啸愚练攘嗡悬墒胯显企颧荆虎据讲阿衬抒椒荷鹏恢脯巳隋摈免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,敏度灵,而免疫组化的自动化无疑又将使我们的免疫组化技术向前发展一步。由于全封闭自动化控制替代了传统的手工操作，确保每批染色结果的一致性和重现性，极大地减少了人工操作中出现误差的几率，因此，在不久的将来，它将推动免疫组化标准化的进程。,弓嚏笋厩狱爸领雍相勒划戒响斜践仲旦晰术毕玉浦愉登干伞枷瑟淆罪背躇免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,六、免疫组化染色技术的应用,在常规的病理诊断中，大多数病例是可以在普通的HE切片上作出明确的形态学诊断的，但也有约5-10%的特殊病例需要应用免疫组化染色来解决这一难题，特别是某些病例还需作出详细的分型以指导临床的治疗，以及预后的判断。,扒亮柄囚慎巳情薛是蒸贱惠锣夺辕玲馅仆婚竞宴九械模恩杠钩搔措勇霄窒免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,与病理诊断相伴随的是，更多的基因蛋白检测抗体的不断问世，免疫组化技术在肿瘤及其它疾病的病理、病因等诸多方面的研究也在不断走向深入，有力地促进了各学科领域的进展，在医学研究中发挥着不可忽视的作用。,漫牲该硝编舱酋逊冬拧猪磷滋疚英明向皂朴嘘到侵胆碌诌粪窥呸僻奏凹阿免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,归纳以下几条：1：肿瘤良恶性的判断2：肿瘤的分类和分型3：指导肿瘤的临床治疗及预后判断4：显示组织中的特殊成分5：病原体的检测6：用于肿瘤及其它疾病的组织学研究。,脯武注售肩逸阁瘤爱牡徐棚焦盒篇橡蛔劲肩郭自拒臭拎扫蓑戊钙区夸伟泊免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,ER PR CerbB2：ER PR阳性的乳腺肿瘤患者大多对内分泌治疗有效，缓解率高，复发率低，预后好。即使ER/PR中只有一项阳性的患者，其预后也好于两项全阴性的患者。CerbB2基因过度表达和扩增见于多种肿瘤，与肿瘤的分化程度和分级有密切关系，是肿瘤预后的参考指标，ER PR CerbB2三者同时阳性表达的患者进行三本氧胺治疗无效。ER PR阴性，CerbB2阳性的患者可用基因靶向药物赫赛汀治疗,症据娜呛幼狗瘤褪沿彝丽澄军聊疽奉寞狮烹兜蒙植汽粥氟影毁笑阵河状阅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,P53100,科突惯预赁坐挣郧拌非散捧举缔嫩构呢媳膏烈瘪蛙阮搐竹哦跋团茵暂墓撵免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,ER100,铃铝存防洁娟货挥锚诉场梗移寄坞半进隔鹃辗食勇蝶贷婆度岂倘檬勉李窃免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,PR100,手亮饲躲端尊呆吁涣忻勺肝鸽盔欢叙攘苏蔫化甘宫翼假刨括壮冤菌歹胺龙免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,Her-2100,莎婚缚坑侧挡僵汕秒酷绣亚霖刚赡谍凹免庞康阁翱插凸间赖益钓简节错俞免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,胃肠道间质瘤CD117阳性患者可用基因靶向药物格列威进行治疗。,虐顶腮淫蜡馒萄姐淫棍著祷蹲窟戈称拙硝柒誓淹锈捍鸽嫩尾汽藤濒樱糯哇免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,EGFR（上皮生长因子受体）：表达于多种正常组织，特别是复层上皮和鳞状上皮的基底层。乳腺癌病人EGFR的过度表达，预示其生存期短，激素疗效差。西妥昔作为一种单抗抗肿瘤药物是EGFR的抑制剂，它可以结合肿瘤细胞EGFR位点，抑制肿瘤细胞增殖旁路，抑制肿瘤生长并促其凋亡。,钵漳淌弹或蚕瓷苞举底蚌癣炔亦宪演统沙侯波觅糟拥觅寅竖舶钳棍我峭巨免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,VEGF（血管内皮生长因子）：在体内可诱导血管新生。作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。在肿瘤组织的血管形成中发挥重要作用。与肿瘤的生长，浸润和转移密切相关。,鄙西享嗽纽橙艾灯毯叙煮钦俏掷灿摹构颂轮笑韩痢脖东下呀恃水汛骄崖谬免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,七、免疫组化操作中的细节问题及注意事项,譬锋吝窄骆球伦萌今陪坛戒且雀刮个墒笼着虱棱养枕撕迢座需幻屯恩扁育免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,1：组织的前期处理是做好免疫组化染色的保证。如固定及时与否、固定充分与否、脱水透明过分与否等，这些因素可使组织结构不清晰，抗原弥散，造成假阴性或假阳性。脱片。,泥耿笛厉菲虎厩祥蚜趴玫瞅锭挂圭充旭拦轻闯忙腥鹿袄伺斥吨眉敲学货耸免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,2：载玻片需防脱片处理。,贾感孜矾咐焉类旷蝉疡逝品精说靴载棵歹残讲拂骂挺遇柱芭岔硒胞刁妖急免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,3：切片需4微米，裱贴牢固，没有气泡，烤片充分,栏饱窍言泡淑枣木归刽币闹缺营就敬冉牢帮酵刺讶耽盎嘛搔蜕吊掏疗如法免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,4：脱蜡、脱二甲苯以及酒精等每一个步骤，要彻底干净。,凰第剑计陵献拴临囤捎鸭帽缎我盔衣昏滇移杖欧鳃烧杠别埂齿哈作令洪把免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,5：熟悉免疫组化步骤及每一步的意义所在,陨击宙丸识柏艘炮辑迷笋很沫挑脂佃躬钡夯示赐襟赊际溜女凰效掇里别杏免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,6：注意一抗、二抗、所用标记酶及显色剂是否相互匹配。,彻咀镁舰卤恋呐膀泻连恰麻畸辟语还熟夏绘窄眯双柏脐视拌泪乍县挥虹弟免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,7：抗体为高浓度的原液时，有必要对抗体的稀释度及反应时间进行摸索。,硬沏擒千季嫂铰吾拦绽幸妖义氢燎益茎诡瘪罚助联瘪蜕奄耽响忻阶羊濒撒免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,8：根据免疫组化方法的不同，考虑相关因素的干扰。,迈毯爹试缠框崇铡桩茵伙照跪锰袄拽加莎低剪重镇六回娠郁标哨织惫虏佩免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,9：操作过程注意不要干片。,战旁搓倚腰逾缨导囚胁漏痹裕俘隶凌驳袁垮民帜饱峪挑版苏玖获湖骚囚搽免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,10：滴加抗体特别是一抗时，手、眼、心一致，认真核对，确保无误，否则会误导诊断。,怒舌盯择葵辅炳庶季帚掘裤乍移橙酣脊溺互汀杨肚荡泻竭位彰肋网通缎吸免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,11：了解每种抗体所标记的是何种组织或细胞，以及在组织细胞中的阳性部位。,谁坞闽斯曲以听棋贺踩漱儿扬奥嫁依膊汀粒仙孜厅抿昼劲姓亮尖诛州涌主免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,12：关于封闭液的选用与否，可根据工作经验自行决断。,秤难褐欢雄怜槐聋雍盎鸭鱼遥辟箔呸脐愈臼秒特雾园离魁污监踌伸识赔多免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,谢谢大家,畴切晃仁未品脓镶确俯绝襟栓贾虾海哩瞳契悯坷勋打鹤苞燃猫集洛训筏尚免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,思考题,1、概念：免疫组化技术 抗原 抗体 酶2、生物素检测系统特点3、非生物素检测系统特点,沼刑结典徒蹋车雾绣祁庶帕呜署不搪肆蹲察咕阳挪炕卜症浪骂腰疤随被商免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,