最新：激光共聚焦与流式细胞及电生理技术荧光原理与激光共聚焦显微镜文档资料.ppt

Con-focal and Multi-photon Microscope Experiment Fundamental,果蝇大脑表达绿色荧光蛋白细胞,光的基本知识,一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小,光波 波长射线 10-510-3nMX线 10-40.1nM远紫外 10 20nM紫外 200400nM可见光 400760nM红外 0.7650M远红外 501000M微波 0.1100cM无线电波 1100M,波长:电磁波波形上相邻的两个波峰或波谷之间的距离，一般以纳米为单位。频率:每秒通过空间上一给定点的电磁波的个数，一般以 Hz 为单位。光传播的速度:30 万公里秒光速=波长频率波长和频率是成反比的关系，即：波长减小，频率增加。,二.光的性质：粒子性 光子（光量子）波动性 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动,波长 光的颜色振幅 光的亮度,波长长（频率低）光子能量小波长短（频率高）光子能量大,=c/E=h=hc/（h:普朗克常量）光子具有能量，光子的能量与频率成正比，与波长成反比,可见光是人眼可以感受到的光，只占整个电磁波波谱中波长从400 纳米到 750 纳米的很小一部分。低于 400 纳米的部分是紫外光，高于 750 纳米的部分是红外光。,反射,折射,衍射,振动方向一致的光在空间相遇会发生干涉相位相同的光发生相长性干涉，相位相反的光发生相消性干涉。,三.光的吸收,光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时，以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量发射光。,光的吸收具有选择性 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收,滤光片 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过,（一）荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光 荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色,三.荧光的基本知识,2.荧光产生的原理,荧光过程：光子激发过程（飞秒数量）：位于基态的电子吸收光子的能量跃迁至不同的激发态能级；振动松弛过程（皮秒数量级）：位于不同激发态能级的电子振动松弛到第一激发态的最低振动能级；光子发射过程（纳秒数量级）：电子从第一激发态的最低振动能级回到基态释放出一个波长较长的光子；虽然整个分子的激发态寿命，只有百万分之一秒的时间，但对于荧光光谱技术和荧光显微镜技术来讲，已经足够用于分析光与物质的相互作用。高灵敏的发射光谱、高空间分辨率和高特异性使得荧光技术成为遗传学和细胞生物学的重要研究工具。,Jablonski 能级图来说明荧光过程：电子的基态轨道和第一、第二激发态轨道。粗线条代表轨道的能级，细线条代表轨道的不同振动能级。直线箭头表示由于吸收光子或发射光子而导致的电子跃迁，波浪线箭头表示由于内部转换或其它非发射过程造成的电子跃迁。,光子能量被吸收的过程是一个全或无的过程：如果被吸收的光子的能量大于一个简单的电子跃迁所需的能量，则多余的能量通常被转换成振动能量或旋转能量；如果光子的能量不够产生一次电子跃迁，则光子不被吸收。,一种荧光分子只能吸收特定光谱的光，用较宽光谱的光照射荧光分子，可以使电子跃迁发生于基态的所有振动能级和激发态的所有振动能级之间，其中一些电子跃迁具有较高的发生几率，这些跃迁的总和就形成了分子的吸收光谱。,荧光分子吸收了一个光子以后，随即会发生一系列具有不同几率的事件：几率最高的事件是电子振动松弛到第一激发态的最低振动能级：这一过程发生在皮秒时间内，被称为内部转换或振动松弛过程。多余的能量转化为热能被周围的溶剂分子吸收。几率次之的是荧光发射过程：即处于最低激发态位置的电子经历纳秒的时间后回到基态，并发出一个一定能量范围的光子，形成发射光谱。,大多数荧光分子可以被重复地激发和发射很多次，直至荧光分子被破坏光漂白(photobleaching)。同荧光发射过程相竞争的过程：激发态能量可以非发射的变成热能；激发态分子可以通过碰撞将能量以另一种非发射的形式传递给其它的分子淬灭(quenching)；,无论那种荧光，其发光机理是相同的,由光激发的荧光 光致荧光,由化学反应引起的荧光 化学荧光,由X射线引起的荧光 X射线荧光,由激光引起的荧光 激光荧光,化学荧光在有生命的生物体中产生 生物发光,光致发光现象：分子被紫外光或可见光照射而发光的现象根据激发态的类型和发光途径：荧光和磷光分子或原子吸收了特定波长的光，经过一很短的被称为激发态寿命或荧光寿命的时间，然后发出波长较长的光的现象被称为荧光过程；磷光过程则具有较长的激发态寿命。,3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针)能够产生荧光的化合物,发射荧光的光量子数荧光效率=吸收光的光量子数,反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率越大越好,荧光素的荧光效率0.35,斯托克斯位移（Stokes shift）,物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。荧光素的发射波长总是大于其激发波长。两者的差值 斯托克斯位移（Stokes shift）；,激发到发射过程中存在能量损失,利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光,4.荧光素的性质,（1）激发光波长和发射光波长,荧光素,激发光波长近紫外区域，可见光区域,发射光波长可见光区域,发射光波长 激发光波长,根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片,荧光,激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)发射光(EMISSION):用单波长的光照射荧光分子并记录发射光的光谱可以得到荧光分子的发射光谱(emission spectrum)；发射波峰(最大发射波长),（2）激发光谱和发射光谱,荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质,激发光谱 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱吸收光谱,发射光谱 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱,用光谱扫描荧光分子并同时记录单个波长的发射光强度可以得到荧光分子的激发光谱(excitation spectrum)；相似地用单波长的光照射荧光分子并记录发射光的光谱可以得到荧光分子的发射光谱(emission spectrum)；激发光谱发射光谱：镜像规则,Wavelength,Excitation Spectrum,Emission Spectrum,EM,原因：1.基态和激发态的振动能级间隔是很相似的。2.在许多情况，电子跃迁到激发态能级以后可以迅速丢失能量而到达第一激发态的最低振动能级。发射时电子的跃迁多从第一激发态的最低振动能级开始的。所以，发射光谱是电子从基态跃迁到第一激发态能级的吸收光谱的镜像，而不是整个吸收光谱的镜像。3.电子回到基态的特定振动能级的几率同激发前电子所在能级的几率是相似的。,激发光谱和发射光谱的用途,激发光谱确定荧光素适宜的激发波长的依据,发射光谱确定荧光素检测波长的依据,最大激发波长EX,最大发射波长EM,激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质,每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱,（3）荧光强度,荧光强度 荧光素发射荧光的光量子数,决定荧光素检测的灵敏度,荧光素的荧光效率决定其荧光强度,（4）荧光寿命,荧光寿命（激发态寿命）电子在激发态的平均停留时间,荧光寿命长 检测特异性和灵敏度高,淬灭（Quench）与漂白(Photobleach)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失。Quench 淬灭是由同荧光发射竞争的其它非发射过程造成的。非发射过程会使减少荧光发射，有时可以完全消除发射。reversible,non-radiative relaxation,collisional quench(oxygen,halogens,amines),static or complex quench(form non-fluorescent complex),Photobleach-是由于光导致的共价修饰和化学破坏而使荧光分子永久失去发出荧光能力造成的。irreversible,destruction of fluorescence,irreversible covalent modification,photodynamic(light and oxygen,free radical oxygen),fluorescence recovery after photobleaching(FRAP),（5）荧光淬灭与漂白,（6）自发荧光,组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 自发荧光,荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）,荧光染料的发展简史,1838年 Brewster首次描述了荧光现象,1852年 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料）,1903年 Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片,1911年 Reicherl发明荧光显微镜,1935年 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色,新的荧光探针，新的检测技术不断出现,荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究,激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope；LSCM）以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测 针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高 分辨率光学切片的荧光显微镜系统。,什么是激光共聚焦扫描显微镜？,共聚焦显微镜历史简介,在传统的荧光显微镜中,来自汞灯或者氙灯的激 发光照射视野中的全部 样品，观察者可以用眼 睛直接观察，也可以用 CCD等设备直接拍摄荧 光图像。传统显微镜得到的图片 容易受到轴向干扰和侧 向干扰的影响而显得有 些模糊。,传统显微镜的缺憾,对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激 发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被 称为轴向（Z）干扰；另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平 面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的 对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰。,焦点模糊,z,y,x,共聚焦显微镜优势,共聚焦显微镜很好的解决了传统荧光显微镜中焦面模糊的问题，解决了图像的轴向和侧向的干扰。共聚焦显微镜同时还提供了光切能力，能对厚样品（例如花粉颗粒，果蝇大脑等）进行三维层切成像。,1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像。1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。,共聚焦显微镜发展历史,Zeiss Olympus Nikon Leica Bio-Rad Meridian,常见品牌的Confocal,由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为“laser scanning confocal microscope”,“激光扫描共聚焦显微镜”。激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不再是普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光，高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处理软件相结合的新型高精度显微成像系统。,共聚焦显微镜原理简介,荧光显微镜术的基本原理,荧光显微镜,激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。普通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490,Microscope荧光显微镜,Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置,Computer计算机,Laser and electronicControl Unit激光光源及控制装置,Anti-vibration table防震台,共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置,共聚焦装置,光源针孔,检测针孔,荧光显微镜,光电倍增管,步进聚焦电机,物镜,Bio-Rad LaserSharp 系统操作，图像处理3-D重建,X/Y扫描装置,光电倍增管,检测针孔,光源针孔,光源,分色镜,物镜,样本,聚集平面,共聚焦显微镜光学原理,检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率的光学切片 激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片 实现三维重建,Confocal Microscope,A point light source for illumination,a point light focus within the specimen,a pinhole at the image detecting plane-These three points are optically conjugated together and aligned accurately to each other in the light path of image formation,this is confocal.Void of interference from lateral stray light:higher contrast.Void of supperimpose of out-of-focal-plane signal:less blur,sharper image.Images derived from optically sectioned slices(depth discrimination)Improved resolution(theoretically)due to better wave-optical performance.,共聚焦显微镜通过两点改进，使我们能够较清楚的观察厚生物标本的荧光：首先是共聚焦显微镜的照明方式与荧光显微镜不同，共聚焦显微镜使用点照明技术：点光源被物镜聚焦到标本上，利用计算机控制的扫描器使光点在标本上逐点扫描；这样在一个时间，标本上就只有一个点被照亮，所以避免了大范围光照射时的侧面干扰。,（LSCM）,激光光源特点：1 单色性好，2 方向性强，高亮度，相干性好,其次，在共聚焦显微镜的光检测器（光电倍增管，photomultiplier tube，PMT）前面设置有一个可以调节大小的针孔（称为共聚焦针孔）。这样，从聚焦平面的下部发出的荧光会聚焦在针孔的后面，被针孔板挡住；从聚焦平面的上部发出的荧光会聚焦在针孔的前部，所以也被挡住。只有从聚焦平面发出的光可以通过针孔达到光探测器。,Confocal Principle,标本发出的荧光通过针孔后被光电倍增管检测到，最后计算机利用光电倍增管的信息组成一幅图像。这一过程，模仿了使用切片机将某些不想观察的组织切掉的过程，只是在这里使用的是聚焦的光，所以被称为光切片。共聚焦针孔的大小决定光切片的厚度。针孔越小，光切片越薄。但是厚度是不可能无限薄的。它还受到那些决定分辨率的因素的影响：如：光的波长、物镜的数值孔径、浸没介质的折射率等。对一个物镜来说，其轴向的分辨率要比侧向的差一倍。如果，使用一个数值孔径为 1.4 的物镜，用波长为 488 纳米的蓝色激发光来扫描标本，如果将共聚焦针孔的开至一个 Airy Disk 单位的大小，那么图像的侧向分辨率可达 200 纳米，可以得到的光切片的厚度是 400 纳米。,Localization and Co-localization,三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞,Real-time Observation,激光扫描共聚焦显微镜特点,图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理；分辨率提高，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；可以实时采集信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径；除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能。,1.虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片，但实际上共聚焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15微米。2.共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。,共聚焦显微镜的局限,1）xy分辨率：Rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜Rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁（11）。2）待测样品最大厚度：约1-2mm.3）样品最小光切厚度：40nm 4）Z轴最大分辨率：0.35um.5）扫描速度：slow：单向：220lines/s 512x512 2-3秒 双向：440lines/s medium：单向：450 lines/s 512x512 1.7秒 双向：900 lines/s fast：单向：1000 lines/s 512x512 0.7秒 双向：2000 lines/s,主要技术指标,共聚焦激光扫描显微镜的应用,共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域,只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca+、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白,1.荧光漂白恢复(Fluorescence Recover after photobleaching;FRAP)检测细胞连接间的信息传递,2.荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.荧光能量共振转移:受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,供体荧光素 受体荧光素,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3),供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3),FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP,Fluorescence Intensity,Time,检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合与分离 大分子构象的改变,III.常用荧光共振转移探针对,3.绿色荧光蛋白（GFP）GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）。,GFP,CFP,BFP,YFP商品化质粒转基因动物:Green mouse外源基因的报告基因:将外源基因与GFP DNA 相连,可实时监测外源基因的表达.检测细胞能否表达某一基因:将待测基因的启动子与GFP DNA 相连,可实时监测细胞能否表达兴趣基因.GFP-蛋白融合技术:将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成,原理:检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内,被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10 xkd 和很多因素有关（pH、Mg2+、温度、与蛋白的结合、等）细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右,4.活细胞内离子动态变化测量,细胞内游离Ca2+测量,KCL诱导的细胞外Ca+内流测量,培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描,