实验八细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记PPT课件.ppt

实验原理,Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。Mito-TrackerGreen为采用MolecularProbes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。,实验原理,Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(NeutralRed)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。,1.实验目的,掌握荧光显微镜工作的原理了解细胞器在细胞内的分布了解荧光染料的使用方法,Lyso-Tracker Red工作液的配制：,a.取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为50-75nM。例如取1l Lyso-Tracker Red加入到20ml或13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。,2.溶酶体的荧光标记：a.去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞28共孵育30分钟。b.去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入500微升预温的新鲜的细胞培养液或PBS漂洗。c.取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。,使用说明：,1.Mito-Tracker Green储存液的配制：用无水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至终浓度为1mM。配制后可以-20或更低温度避光保存。,2.Mito-Tracker Green工作液的配制：a.取少量1mM Mito-Tracker Green储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1l Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+&Mg2+(C0219)可以向碧云天订购。,b.Mito-Tracker Green工作液使用前需28预温育。注：工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。3.线粒体的荧光标记：a.去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞28共孵育15-45分钟。b.去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入500微升28预温育的新鲜细胞培养液或PBS漂洗。c.取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察。d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。,1 打开可将光和激发光光源（预热10分钟）2遮光板遮住激发光3 选择“1”，在可见光下，聚焦，观察清晰图像，再调到高倍镜下，微调至清晰4 关掉可见光光源，打开遮光板，让激发光透过5 选择“G”观察红色荧光6 选择“B”观察绿色荧光,