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细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。,定义,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物细胞壁的组成和结构。,细胞壁的组成和结构,细菌 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；霉菌 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高；植物细胞 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,常用破碎方法,机 械 法,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理：,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。,胶体磨,德国进口珠磨机,2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用,高压匀浆器的排出阀,易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌,不宜采用高压匀浆法的细胞类型。,影响匀浆破碎的主要因素：压力、温度、通过匀浆器阀的次数,大、中、小型高压匀浆器,利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。,3.超声破碎法（Ultrasonication）,影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。,非 机 械 法,1.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等,利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,酶溶法的缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2.化学渗透法（Chemical permeation）,Triton X-100牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠,（1）表面活性剂,表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。,通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,其他方法,1.X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.渗透压法（Osmotic pressure）,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。,3.反复冻结-融化法,此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。,4.干燥法,破碎率的测定与破碎技术的研究方向,1.破碎率的测定,直接测定法（革兰氏染色法）目的产物测定法导电率测定法,2.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合,第四节 固液分离,定 义：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。,一、过滤,过滤介质,无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。,过滤设备的分类,根据推动力的不同可分为四类重力过滤自然过滤加压过滤板框过滤真空过滤真空过滤器离心过滤离心过滤器,过滤设备,板框过滤机板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。板框压滤机工作运行的原理：先由液压施力压紧板框组，料液由中间进入，分布到各滤布之间，通过过滤介质而实现固、液分离的脱液方法。,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌（需预处理）等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,滤板与滤框的工作情况,优点：结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围广。缺点：设备笨重、占地面积多、辅助时间长、生产效率低。,板框过滤机,真空转鼓过滤机,优点：真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（10）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点：由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,真空转鼓过滤机,二、离 心,定义：基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,离心分离方法,1.差速离心工业上最常用的离心分离方法,定义：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。对象：混合样品中各沉降系数差别较大的组分。,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。分类：1）移动区带离心 2）等密度离心常用密度梯度物质：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr,2.密度梯度离心多用于生化研究,1）移动区带离心,用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。此法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,2）等密度离心,细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在该层达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,A移动区带离心 B等密度离心,离心机分类,制备性离心机,分析性离心机：超速离心机,普通离心机,高速冷冻离心机,超速离心机,实验型离心机,工业型离心机,碟片式离心机是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片,管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6105。它设备简单、操作稳定。适用范围 细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量1%发酵液的分离。,影响固液分离的因素,微生物种类真菌的菌体大，固液分离容易，可采用真空转鼓式过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要进行预处理。发酵液黏度固液分离速度与黏度成反比。其它因素培养基组成、发酵周期、发酵液的pH值、温度和加热时间等,思考题:,1.细胞破碎方法有哪些，它们各自的适用范围？2.发酵液分离的主要方法有哪些？3.分离和过滤的主要设备有哪些?,
