最新脂肪来源干细胞ADSC 之生物学特性、分离、应用前景课件PPT文档.ppt

前 言,脂肪组织来源的干细胞最早是有Zuk等人从抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离培养出来的，并证实为多能干细胞，称之为adipose-derived stem cell(ADSC)。在适当的诱导条件下ADSC能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及神经组织定向诱导分化，最近更是有将其定向诱导成为心肌细胞，证明脂肪组织这种原本不太受人欢迎的物质有可能成为人干细胞库的重要来源，并可作为多种组织工程的种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。,第一部分 脂肪干细胞的生物学特征,ADSC的干细胞性质,对ADSC进行了大量的分子学和生物化学鉴定，其结果为（1）ADSC表达的CD免疫抗原和MSC表达的相似。（2）通过-半乳糖酶染色分析，ADSC在经过多次分化后依然保持很低的细胞衰老程度。（3）在体外情况下ADSC在不同培养基的条件能够分化成脂肪、骨、软骨和肌细胞。这些证据都可证实ADSC的干细胞性质。,免疫表型,用流式细胞仪和免疫组化方法研究发现，体外培养的ADSC课表达如下蛋白：1、粘附分子CD9,CD29,CD49d,CD54,CD102,CD106,CD166.2、分子受体:透明质酸盐（CD44）和转铁蛋白的受体（CD71）3、细胞外基质蛋白和糖蛋白：I型胶原、骨桥蛋白4、肌蛋白：平滑肌细胞内的机动蛋白和波形蛋白5、补体调节蛋白：衰变加速因子（CD55）和补体蛋白6、组织相容性抗原：能表达I类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不能表达II类蛋白HLA-DR。,体外扩增,体外培养条件下，ADSC不像骨髓间充质干细胞对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求。DMEM，MEM，RPMI1640是ADSC的常用培养基。一般只添加10%胎牛血清，并且血清无生产批号限制。在传代培养中，ADSC平均倍增时间为60h，细胞在3-4d即可增殖一倍，培养的细胞可以稳定增殖和传代，体外培养10代以后，细胞的增殖速度亦没有明显减速。ADSC并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5%细胞出现衰老，15代时仍低于15%，这表明ADSC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。,调节淋巴细胞反应,研究发现1、ADSC可明显抑制PHA刺激的淋巴细胞增殖，IL-2可逆转ADSC的抑制作用。2、ADSC可明显抑制双相混合淋巴细胞反应，抑制作用成脂肪干细胞细胞数量依赖性；经IFN-作用后抑制作用未见明显减弱。结果表明，ADSC可在体外抑制淋巴细胞增殖反应，具有一定的调节淋巴细胞反应的能力。,ADSC形态和细胞周期,脂肪来源的干细胞呈梭形生长，并呈现成纤维细胞样形态，胞浆和核仁丰富，呈平行排列或漩涡样生长。脂肪来源干细胞原代培养仅有少量细胞贴壁，在低密度状态下呈大的扁平状单层细胞（直径25-30m），当细胞长满培养瓶趋于融合时，细胞体变得细长呈梭形，形态与成纤维细胞非常相似，该细胞表达中胚层来源细胞的标志物波形蛋白，且与骨髓基质细胞形态相似。细胞周期分析显示，G0/G1期的细胞占69%，S期的细胞占24%,G2/M期的细胞占8%。,应用脂肪干细胞研究的优点,1、来源充足，取材量大，能反复取材，脂肪细胞中干细胞含量远远高于骨髓中的干细胞含量。2、属自体移植，无免疫排斥反应。3、不涉及医学伦理问题。4、取材简便，分离容易，避免抽取骨髓，损伤较小，患者易于接受。5、细胞增殖快速。,第二部分 大鼠脂肪干细胞的分离培养,1.大鼠腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg达到麻醉效果，用体积分数75%的乙醇逆毛方向消毒。2.无菌条件下切取双侧腹股沟脂肪，置入含有1000U/ml青霉素和链霉素PBS液中浸泡10min，然后用不含抗生素的PBS液反复冲洗，仔细去除大体可见的血管和其他组织。3.将脂肪组织剪成约1mm1mm1mm小块，置于10ml的0.1%的I型胶原酶中，37中摇床120r/min消化30min，待悬液成糊状，加入3倍体积PBS液终止消化，以1200g离心10min，弃上清，沉淀用含体积分数10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM制成单细胞悬液。4.以2105/cm2密度接种于培养瓶中，置37、体积分数5%CO2培养箱中培养。48h首次换液后每3d换液，每天显微下观察、记录。,第三部分 脂肪来源干细胞的应用前景,1.辅助或替代骨髓移植治疗。脂肪来源干细胞表达和骨髓来源的间充质细胞相同的粘附分子，也可以分泌和骨髓来源的间充质细胞相同的细胞因子。2.作为组织工程的种子细胞。(1)修复损伤的骨、软骨、神经、肌肉等组织的缺损。(2)美容整形外科：自体脂肪移植，如充填面部皮下凹陷性缺损、隆胸、吸脂术后的凹陷等。3.治疗心肌梗死后心功能不全。应用细胞移植来替代不可逆坏死的心肌细胞4.其他 糖尿病、肝脏纤维化等。,应用示例,谢 谢,