RNA干扰抗乙肝病毒PPT文档资料.ppt

摘要,1.RNA感染严重影响公众健康。2.通过RNA干扰活化剂可使核酸安全持续地沉默，从而治疗慢性HBV感染3.合成的短链干扰RNAs可以通过非病毒载体在胞质中传递到合适的位点，从而实现基因沉默。4.虽然这种技术已取得令人瞩目的成就，但实现其临床应用还面临挑战。,引言,世界卫生组织估计世界已经有20亿人感染了乙肝病毒，其中3亿5000万人已经发展为慢性，持续的感染增加了肝细胞癌和肝硬化的风险。肝细胞癌在世界上最常见癌症中排行第六，并且在导致死亡的癌症中排行第四。,乙肝疫苗对于慢性携带者在预防感染和肝细胞癌方面却几乎没有任何治疗效果。可行的HBV治疗方案包括核苷类似物和免疫调节剂，但是也仅有有限的功效，并且代价很高，包括相关的副作用和耐药性发生。通过RNA干扰的途径来抑制感染的方法依然占据主导地位,乙肝病毒基因结构,乙肝病毒的基因组包含部分开环的双链DNA(rcDNA),该核酸被衣壳包裹，同时被具有传染性的乙肝病毒颗粒所包裹。负链DNA大约有3.2KB长，该链包含了整个HBV的基因组。正短链DNA更短并且在长度上更具有可变性。正链位于5和3负链的末端以维持rcDNA的圆形结构。,肝细胞感染后rcDNA被释放，同时在胞核被修复以形成共价闭合环状DNA，它也作为模板转录乙型肝炎病毒的RNA。共价闭合环状DNA的四重叠ORFs能编码产生七种病毒蛋白。其中包括表面蛋白、酶、核心和e抗原。四种病毒激活子和两个增强调控序列，大于3.5Kb基因组长度的前基因组RNA以及2.4kb、2.1kb和0.9kb亚基因组mRNA的生成。前基因组RNA的逆转录导致乙型肝炎病毒的基因组rcRNA形成。,RNAi机制,RNAi的机制是高度保守的转录后基因沉默，它被双链RNA触发，由22个核苷酸序列构成的小分子核苷酸。,RNA聚合酶II促进因子,初始小分子RNA,前体小分子RNA,加帽,RNA诱导沉默复合物,RNA诱导的沉默复合物在5端热力学稳定性很差，故被选择为成熟miRNA的向导。miRNA向导与mRNA3端未翻译区域结合实现基因沉默。即与同源靶向mRNA之间完整互补，从而使mRNA降解。,外源性RNA干扰活化剂,合成的小片段RNA是由21-25核苷酸长并带有特征性的2个核苷酸3末端的双链组成。这些合成的siRNA有效的表达抗病毒序列使乙肝病毒在体内外的复制沉默，从而达到治疗慢性乙肝病毒感染的目的。,为了能有效的在肝细胞内表达，表达基因盒通常合并为重组病毒载体，而siRNA通常使用合成物或非病毒载体来转导。,抗乙肝病毒RNA干扰药物的开发阶段,首先要解决RNAi能否有效的释放到已经被乙肝病毒感染的肝细胞内，其次是实现持续的病毒复制沉默。分析评估疗效通常使用分步法，包括有效的选择抗HBV活化剂，融合于一个合适的载体里，同时测量抗病毒活性以及描述非目标效应。,RNA干扰活化剂的优化,首先需要考虑的是有效性和安全性避免错误的细胞内mRNA的沉默确定有效沉默所需要的最低浓度防止病毒逃逸药物同时减少源于先天免疫应答诱导以及细胞内mRNA错误沉默所造成的毒性。,人工合成RNAi活化剂,首选方法是使用位于子区域的核苷酸的化学修饰引导化学合成的小干扰RNA进入细胞内涵体，这些siRNA常被视为异己，从而导致先天免疫应答的激活。,表达RNAi活化剂,理想情况下，表达的活化剂应该是专门针对乙肝病毒的，因此应该有一个偏移以利于诱导引导链抗乙肝shRNA盒的另一种途径涉及到前体miRNA往返序列的利用。由于它经常出现多顺反子，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多个目标HBV。,病毒复制模型中RNAi激活剂的功效和毒性测试,乙肝病毒复制模型的一个重要缺点是它们不模拟乙肝病毒生命周期自然初始感染步骤。模型中的复制只是暂时的，并且这个过程本身就有肝毒性。液体注射和转基因小鼠模型的一个重要限制是CCCDNA不在这些动物肝细胞中形成。,鸭乙肝病毒和土拨鼠肝炎病毒与HBV高度相似，故也已被用来模拟人类乙肝病毒感染。黑猩猩可能适合RNAi激活剂药物的疗效评估，但也有很大局限性,提供乙肝病毒载体的RNA干扰活化剂,载体能够高效安全的转导抗病毒药物，并且适合大规模制备，并且可以实现重复给药。包括病毒载体和非病毒载体,病毒载体,重组腺病毒：具有天然的肝脏亲和性，能够实现外源性基因在体内持久的表达。聚乙二醇化的重组腺病毒载体中的聚乙二醇由于减弱了免疫刺激和肝毒性，同时改进了重复给药后的沉默，故以成为主流基因治疗载体。,重组慢病毒载体也可用于RNAi抗乙肝病毒治疗，优点：在细胞周期G1阶段感染增强前病毒DNA稳定整合使RNAi表达延长,慢病毒载体能够实现体外肝细胞转导，优势：选择性肝细胞修饰消除免疫刺激导致的抗原呈递细胞载体转导减弱有系统的全身给药所带来的全身毒性或炎症反应。,面临的问题：如何获得足够的移植细胞以供转导乙肝病毒耐药肝细胞的选择优势实现长期转基因治疗的表达避免插入突变避免植入转导的干细胞具有的潜在致癌性,非病毒载体,包括阳离子脂质核酸复合物，脂质，核酸聚合物以及修饰的脂质复合物NVVs能被浓缩以及中和核酸的负电荷以形成统一的直径小于100纳米的小颗粒，从而有利于与有窗孔的肝毛细管交联。siRNA有效负载的保护和避免与宿主蛋白的相互作用是其优点。,优势：能够被化学修饰可以实现大规模的合成与siRNA能够良好的兼容免疫原性可以随着配方的不同而变化,结论,以RNAi为基础的抗HBV药物尚未达到临床测试的阶段。RNAi有效和特异性HBV复制比例通常大于90%，对于治疗以足够，但由合成间接siRNA RNAi激活剂造成短暂的失效需要重复给药。,抗病毒沉默的脱靶效应引起潜在的副作用免疫刺激作用和错误的细胞信使RNA沉默也是急需解决的问题合成和表达的RNAi活化剂的剂量调节仍然是个难题。带有固有缺陷的替代模型的使用不能完全模拟HBV感染的人体,