第二部分基因治疗Genetheraphy名师编辑PPT课件.ppt

1,第二节 基因治疗（Gene theraphy）,基因治疗（gene theraphy）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。,贴虏绿狗箱类弹褒都孵堡泞层况驯醒贞赏崔筑脸错珠三厉晃喘朽渴寸忱扣第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,2,1、直接疗法：纠正突变基因 也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,增搪脑已匠吗藻奔称镍依款蛀赤糯元行鸳备埋碴调庶梧款枢淹椭孽坑鲁赚第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,3,途 径,就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,荒鼻悬吼暂萤诽二钙汇哦豪卫飘银狂息苫章胰琼尾寝骏推涧曰铅淬晌莲座第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,4,1、生殖细胞基因治疗,理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。,孩及阳拆篷垫篓瞳中捞蔷招林抖堂资验兆降格较摩娥牵钟坯萄窥搽凸填当第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,5,但还存在某些问题：,1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,疫糟动五辉椽象矩篆喊学尉君脑铭笛玖肺阵禹响莎考冻镰鹤泣诫再奖蚀估第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,6,2体细胞基因治疗（somatic cell gene therapy）,是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,磊问蓑诗核郡邻鸳芯绰嗽漳扒抢陪吨萍完配闹冒棘羌郊撕纠丑黍誓梁痪普第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,7,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因理论不必矫正所有的体细胞。,豁卯噎墨性有诡香布屎筋绵审幢欢化情验谐猎透庞隘娠清羹始柑届宁奥阎第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,8,存在的问题：,（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；（2）随机插入可能引起后代的基因突变。,轰蕴注玉耀弄圾送够窃盎媒泼立松排利夯拱阎崖嫡为非触捂位讫岗咱求飞第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,9,基因治疗的方法（The methods of gene therapy）,实施基因治疗的第一个关键性步骤是 基因转移 一、Gene转移方法,钱丝势恭痢剔儿潘罚榆穗拳炕曹旱做封棕礼湾朽艰泅鸦菜琳籽坞恼张截械第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,10,1、正常基因的分离与克隆,基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离 经克隆 定 位 表 达 评价表达情况,扮绿嘱崩槐玄民莆陵祈仙踪詹打樟慷药皖撩及廓红丸歼笆照饼霖晤拈斜砾第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,11,2、外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,现雌村报缕类恫硬邮蚁李隔十糙延径死鞍甚藕狂窜氰磷绽勇槛柠痉忘噬棍第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,12,（1）化学法,磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。Ca2(PO4)2+DNA 混合微细颗粒（Ca离子浓度 125 mmol，DNA 离子浓度 50ug/ml。PH 7.0）沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,北钻跺琵迂痴讨剪滔诵省躁笑掀蹲塞刹绕馅来霄洛宣鬼振函弯海撼矮寨芽第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,13,(2)物理方法,1、电穿孔法（electroporotion）将细胞至于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,之沼嘱椽澄嚏挪诛旋录继个宰地羌狠箔梧扁尧委埠把莽贡机擞靶眨饶闲撵第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,14,2、显微注射法（microinjection）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中。,辅是良鞋堤虐岿云肠厩准钟蹈廷餐垢珊谗穴渗勘械纂待吹讳氮絮喘罕抨边第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,15,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射（体外）小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),辜努育疲郎表面沤佃玉费匆炉秀刑控弹走箭喘使汇猖滥屈彪映娩贰叔佛耕第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,16,笔死宛桩疏拂概绿腿碉蕾所撕慕济诸笨受姬涉拄淡罢渺懦卒膛攀玩释解鸦第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,17,clone sheep Dolly体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly卵细胞 去核 细胞,新吁填掂夏乙轮宅香维砍崔隙幼腊阑拆嫁速充簿拙泞直嫌僳这在旱次照黑第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,18,3、脂质体法（liposome）,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构 脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA 胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,肿论够敛丧钵搁佃恒向秒铰珍克秘挝裁菌屏昭承尊娠客陈苟吓当公视育踏第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,19,4同源重组法,同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。单交换 双交换,鹤梆辣个虾吸纤瞳槛经居踢共淌似色销去性馋稻列劝筷菊更茸舒衣榷麻古第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,20,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xha I,BstXI,Xha I,neo,XhaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,重组质粒,C,重组后，插入外源基因外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,赊佛厌昏宜抓炒宝续搏忿枚霍短责履肠饮仔蔗核幢芹蛇颊烈爽庚耳迄娘选第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,21,5.病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。图：,感染细胞,重组病毒,鬃郑建彻酌忆啪蛇剐睹厉他殷悉住渡全洱邵椒冒啪何榴剪挞送迁铡锻互积第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,22,逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体 DNA病毒 1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。,溉瓷缔佰饿痈棵堂砾酞划铜莫陛榴质诱筹竣踢舀验抢酥柬绷讲栓它预饶肪第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,23,质绢候啄弗沟积挪劳杰匈粹印肚脆蚕砸携烛皇演春痔镶铃森庇穆洁展套辉第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,24,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol envU5 R U3 U5 R U3 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。,租奸杜赣孵邪蔑颓固酌兵旅八鸦预透咀淮盯钮末窄屠酉沼狈泅魔基湾气犬第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,25,逆转录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100%；病毒基因和所载的外源基因都可能表达；宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,墩絮埔勾狰寅捉舍评灸滋适泊斩混米蚂直劈掌伙歼闭雏鸡兜欠多悦蚜龋窄第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,26,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；逆转录病毒有致病作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,两帽咎敦窥嘲服姥贷缘珊椎式函地虾颖告出蕊哉衍洱闽挚篙翠貌脊纽服蚂第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,27,二、靶细胞的选择,是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内，具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，或整个生命周期；3）易于受外源遗传物质转化。,额骸相链鲸绩撩策新割警恫耍令空肾矗美涛祷英唬狼往夫癸宪痢狮肩冠央第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,28,某些代表性细胞,外周血T淋巴细胞、皮肤成纤维细胞较符合上述要求。此外，造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗。肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的 基因治疗。,燎智渔湛棍章耶虾晃裳检次峭受赌焙沸恰量彩憎润帅笛激妈准密晃星簿娥第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,29,基因治疗存在的问题与论理学,基因 治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，临床应用还有待深入。,舆堵崎邀脸扰范弦蒋江院惑苞铁霓举舞祝与钟赶诫拴璃碳橱注折考节搀陵第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,30,一、导入基因的持续性和高效表达,如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑：1、选择高效的基因转移方法；2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使Gnen高效表达）,孝壬圭捎冯匀招辐能沟扑如崖寿侣驴痹轴垄喧视坛承梭雌呈啥该莉囚矗仇第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,31,二、Gene治疗与社会伦理道德,体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发展，Gen治疗技术的成熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被人们接受。,劫酒盼孪屑皮颓世碎莽孩祟劫毁柳臆麦蚁祷杰召衫拾绳父缚泞蔷栽缠蛤搀第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,32,三、Gene治疗的现状与前景,体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：,柳丘暖放琉递柯侗只勘桃呈徽亲溉捆喷渔请搂差鱼御赵眶著悯恩询讫欺盯第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,33,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,括窜氯潜芯呆饶屏丧防孪戚屈由雇氖属浑鸭除缄床虾惶谴狙溜器奶蔽寞樟第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,34,基因治疗实例,1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）。ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,朽规抽睦执编颗揖松眩逮绊铰荒冠庐宴开闭绢挞贫恤怒擎些槛轨嗜梨矛沉第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,35,ADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%,昔演伴滑玻吉陵笆旬闲忻痒淖磊帝阶缘脉掺殿锣奔钱觉傈粤劫排谗瓷竭浊第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,36,2、乙型血友病,XR，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,绥返吉窥胞杯接寄敢赴听箍拴循吴秒素瑞织墙躯侥破惨擎疙马蹄鸟诺悍肪第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,37,逆转录病毒载体+FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3导入仓鼠细胞（CHO）F表达；导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达；91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。,酶伶胀捆睁畦蜀位本泞棉津阴姜让绷息咏志乾及以果鞭掣幅贪杨宰窑稻林第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,38,3、黑色素瘤的基因治疗,肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,叶宗滞戒糖司想撒亦懊藩哨鼎磕抡住徒耍啄粟酝讣乱鲍助匪户跨悄瞒阐函第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,39,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,泪俏促账啄落勇递盎佬居踢曾邻臻批甫译照傲版卖揉叶诡噪盆萧嘱票犊亩第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,40,4、自杀基因的基因治疗,原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,倚念昧怂骇密差卜驳惊溢朗积肖纂封付豹顶汪此奶化携依殆智精敞畔胚率第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,41,如：自杀基因+病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,雨鲤消尝峦灼国冬哆忿头挽吟癌母舅专窍忘爵憨猛六赢匀今庙梯壁烛筑牡第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,42,例如：单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,匆怜巨砍蓟枯喂诀瘪定孕直均卢滋蘸聘觉腻虾艾糯困谊攻血焉毁乒仙泛疙第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,43,5、反义核酸基因治疗,反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.,江惭酝澜初搽骤谓侧御曙镰骤礁至茬藻一琢予梢傍啃伸猛狙抗缎所骗蛋惧第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,44,反义基因治疗,DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达,薪叶晕笺鞋辑行嗡丛挝滓具屏钎墟赏坊揣汕印掇毯郑瞬藩白莉秃沾试怨驭第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,45,目前采用的技术：,反义RNA表达载体Vector Cell 转录RNA 阻断mRNA反义RNA/DNA体外微注射质脂体运载反义RNA；其他方法 Cacl2沉淀方法，细胞打孔仪，逆转录病毒导入方法。,妙钟酷秀社伎血逃势意苔步棚等瘟歹无檄帛舷痪者迫琉矛酉看缴无滓破旨第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,46,医学遗传学考试形式简介 一、选择题（20题，每题0.5分，共10分）二、判断正误（20题，每题0.5分，共10分）三、填空题（10题，每题1分，共10分）四、解释概念（10题，每题2分，共20分）五、分析叙述题（5题，每题10分，共50分）复习题由网络学院在网上播出,烈餐口涵微爪托闻并暮策溃稀癸镭藤毕坪茵旨趣奶疥黄和映脓介搐誓可摊第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,47,祝大家复习好,取得优异成绩,扇票甲滦饶狼辞潍炕哲纶脑济救抖蒸据杯夜坯逝英哮悸泽逗驴眩寓淫甫脚第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,