02细胞生物学研究方法4学时文档资料.ppt
细胞形态结构的观察方法Methods for observing cell morphology and structures细胞组分的分析方法Methods for analyzing cell constituents细胞培养、细胞工程Cell culture and cell engineering细胞及生物大分子的动态变化Dynamic analysis of biological macromolecules in cells用于细胞生物学研究的模式生物Model organisms in cell biology,第一节 细胞形态结构的观察方法,各类细胞直径的比较,光学显微镜的分辨率resolution of optical microscope,分辨率(resolution)区分开两个质点间的最小距离.,对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。,普通光镜的最大分辨率是0.2m。,一、普通复式光学显微镜技术,1、普通光学显微镜 light microscope,2、相差显微镜 phase contrast microscope,将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对比度，构造上的特殊之处：环形光阑（condenser annulus）相位板（annular phase plate）用途：可以观察未经染色的标本和活细胞,F.Zernike于1935年发明并因此获1953年诺贝尔物理奖,倒置相差显微镜 inverted phase contrast microscope,物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，可以用于观察培养皿中的活细胞。,3、微分干涉显微镜 differential interference contrast(DIC)microscope,在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强,4、荧光显微镜 fluorescence microscope,为落射式照明，即光源通过物镜投射于样品光源为波长较短的光，分辨力强用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光,集多种功能于一体的万能研究显微镜,兼有明视野、相差、微分干涉、荧光、显微摄影等功能，是高级研究仪器。,5、激光共聚焦扫描显微镜 laser confocal scanning microscope,激光作光源；通过检测器前小孔成像；扫描激光聚焦点也是瞬时成像焦点共聚焦。分辨力为普通光镜的1.4-1.7倍.,Epi-fluorescene,Confocal,荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较（小鼠肾小球）,Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin,a green-fluorescent lectin,was used to label elements of the glomeruli and convoluted tubules.The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush border were stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin.The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI.Molecular Probes FluoCells prepared slide#3(F24630),Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30 Oil,Zeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr,梁凤霞提供,荧光观察细胞结构细胞内的动态变化FRETFRP,鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，1932年研制第一台电子显微镜，1986年获诺贝尔物理奖。,二、电子显微镜技术 Electron microscopy,1、光镜与电镜的主要区别,（1）光源不同:可见光/紫外线-电子束（2）透镜不同:玻璃-电磁透镜（3）真空（4）显示记录系统（5）分辨率:0.2 um-0.2 nm,1、透射电子显微镜 transmission electron microscope,TEM,透射式电子显微镜用于观察小于0.2m的细微结构，称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures）.,Figure 3-20.Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions.,超薄切片制样技术,取材固定脱水渗透、包埋超薄切片 厚度40-50nm染色,电镜的实际分辨率与切片厚度有关,负染色技术 Negative staining,负染色是用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。,Figure 3-29.Electron micrograph of negatively stained actin filaments.Each filament is about 8 nm in diameter and is seen,on close inspection,to be composed of a helical chain of globular actin molecules.(Courtesy of Roger Craig.),亦称冰冻断裂，主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,冷冻蚀刻电镜技术 Freeze Etching electron microscopy,2、扫描电子显微镜 scanning electron microscope,SEM,20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。,Figure 3-23.Scanning electron microscopy.Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog(A).For comparison,the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy(B)and by thin-section electron microscopy(C).,三、扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope,STM,Binnig和Rohere 1981年发明，1986年获奖；可观察到原子级的图像。,X-ray crystallography X射线衍射,B.NMR spectroscopy核磁共振成像,第二节 细胞组分的分析方法,一、用离心技术分离细胞器与生物大分子,普通离心机：转速25000 r/min超速离心机：30000 r/min,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。,1、差速离心 differential centrifugation,细胞器沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体。,2、密度梯度离心 density gradient centrifugation,用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖分为速度沉降（velocity sedimentation）和等密度沉降（equilibrium sedimentation）。,其它生化分离方法,纸色谱,柱色谱,亲和色谱,Figure 3-42.SDS polyacrylamide-gel electrophoresis(SDS-PAGE).,Figure 3-44.Separation of protein molecules by isoelectric focusing.,Figure 3-45.Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.,二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显示方法,为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理加以显示，称为组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）；如：细胞内DNA和RNA的原位显示,Myofibrillar ATPase:Identifying Fast and Slow Fibers,Succinate Dehydrogenase(琥珀脱氢酶):Identifying Oxidati ve Potential,Promoter:GUS,是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物有荧光素和酶免疫荧光法（immunofluorescent technique）酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）,免疫细胞化学 immuno-cytochemistry,二、细胞内特异蛋白质的定位和定性,免疫荧光法,酶标免疫法,利用分子探针检测细胞内特殊DNA序列、和RNA基因表达的方法。,四、细胞内特异核酸序列的定位和定性,原位杂交（in situ hybridization）,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,果蝇HB基因表达的原位杂交照片,五、定量细胞化学分析技术,对单个细胞进行快速定量分析分选的一门技术；,流式细胞术 flow cytometry,第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,活体或在体(in vivo)离体或体外(in vitro)细胞培养(cell culture)就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术；,原代培养(primary culture)：从动物机体取出进行培养的细胞群。传代培养(passage)：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。细胞株(cell strain)和细胞系(cell line),一、动物细胞培养cell culture,二、植物细胞培养,组织培养(tissue culture)：诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培养出再生植株 单倍体培养(haploid culture)：花药或花粉培养获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体原生质体培养(protoplast culture)：,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异核体；诱导方法：生物(病毒)、化学(PEG)、物理(电激、激光)。,三、细胞工程 细胞融合,单克隆抗体技术 monoclonal antibody technique,英国人Kohler和Milstein 1975年将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖,显微操作技术 micromanipulation technique,第四节 细胞及生物大分子的动态变化,一、荧光漂白恢复（fluorescence photobleaching recovery,FRP）技术,荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP),二、荧光共振能量转移技术fluorescence resonance energy transfer,三、单分子技术single molecule techniques,光镊（Optical tweezers）磁镊（magnetic tweezers）原子力显微镜（atomic force microscopy）,How do muscles produce works?,研究生物大分子在细胞内合成、分布、定位等；一般用3H，14C，32P，35S，135I，45Ca等；放射性同位素标记切片或涂片 曝光 观察,五、放射自显影技术 radioautography,135I,四、酵母双杂交yeast two-hybrid system,研究蛋白质和蛋白质之间的相互作用。,线虫,果蝇,拟南芥,第四节 用于细胞生物学研究的模式生物,大肠杆菌,酵母,小鼠,作业题,名词：ultramicroscopic structure,flow cytometryphase contrast microscope，in vivo,in vitro,immunocytochemistry，cell culture,monoclonal antibody用于细胞生物学研究的显微镜有哪些？其主要用途？如何分离细胞中的细胞器，如线粒体和细胞核?如何对细胞中的特异蛋白质和mRNA进行定位？你对于细胞工程技术及应用有哪些了解？举例说明单分子技术在细胞生物学研究中的应用。,
