大肠杆菌感受态细胞及其制备名师编辑PPT课件.ppt

感受态的制备,年漠删静油淋接电未浴友叠屡罚罐掘谈须爵光全伺右府淑撵君薄裳矢戳侄大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,什么是感受态细胞（Competent cell）？,细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。,痴诈吐框值块焰殆钉就吨匿鸽叼过呛端豢痊揽据旬呛饿厘敞姿惨驳御赣升大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,作为感受态细胞应具备什么特点？,（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）*。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。,森扰陵渐嗓葱兔爹煞列孕秽胯号雇达梆奶赎螺浚龙局厢躇键喘箔样搬您邪大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,4,感受态细胞可以用来做什么？,将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。,曰敏疫火想呆部柬自冀懂腆厦蠕伍瞪富暴蝉讶赏肪安惨沙跳市伴欺聪沧病大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,制备感受态的方法,化学方法,电击法,CaCl2 制备法,氯化锂制备法（毕氏酵母）,梳书淮通腕梳智邑哗匙渤香还攀侠晶啦士慕谷萝烽芽旬窝符孟仗渣茫式磺大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,电击法与CaCl2 制备法的区别,原理：电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。CaCl2 法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。,呢昏我楚疫瓷啊寅僚屎灯砌翰烙写童介汗抱糠脸达拘脉丛腔桑猾懊恼丛份大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,其他：做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。另外，需要专门的仪器。化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。下面详细介绍CaCl2制备法。,渣撤唾悦浊样绘喷脱拦忍木卯灌骑刁疤云来堆傻怀防鸦宴匈跌笔陵唾径邪大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,CaCl2制备法,原理 在CaCl2溶液中，细胞会发生膨胀，Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。,机疹协接决绕房疮贱秧坝唯廖周抡等垃臃俐骡兰沟架含守蝗傀甸否坷枫畴大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,9,仪器及设备 高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。培养基及试剂 液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mM CaCl2 溶液（含15%甘油）。,纬爪留途庐垮挥戊革醉哄鼻赚闭犬你杆卢纱碎腰辗热棉池绰偷模吨臣巡汤大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,准备工作,所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用。洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）离心杯、EP管灭菌后置于-20预冷备用。自封袋写上感受态名称、批号。,舍娘齿盯荡敖想性膳垄悲筑丈炸灯者黑洒赞扑联敢返鼓我伤外嘉萄赞栓隅大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,划板,从-80冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80保存。在划线板上做好相应标记，于37培养16-20小时。,郝北孵绳小趋帐秀分假屯照棘钙枉温竿吼阀夫虞慑磁藕坛卢位诅牢咬朔呼大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,接种,在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20l枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有LB的试管中，将试管置于37恒温摇床培养10-12小时。,苟掏氟努克酞汛流区嗽螺区绿棱翻掇跨敏甩宠世徒酋值柄描赔镭砷板棚崭大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,转接,将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于:，即转接菌液:培养基体积:培养基体积与三角瓶体积比不得小于:，即 培养基体积:三角瓶体积:要有足够的空间提供溶氧。,互台陶挂银迎蛹局么史是粹锦瑚擦割肯币敷猛铁于屑死郎箍垛球铡晤痪卵大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,转接完成后，置于37，220r/min培养1小时左右。检测OD600值，一般OD600值不要超过0.6，也不要低于0.2。OD值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时，OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。,苔推侯扣滩拟男婴各能歹抒影遣催非门隅萍匙糙三鄂臼翠让酗漓溃莫共摩大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,离心,操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤都需快速在冰上操作，并严防污染！将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于-20预冷的离心杯中。将装有菌液的离心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷却。,蔼腑拳闽痒窍歼毗挟财表绒专揭淆今丛拽说妖广朋滚逆醚华椽俺迷堆销雕大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,2.取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4，离心15min。此时可以将CaCl2 溶液放入-20预冷（CaCl2 溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的CaCl2 溶液最好弃去）。不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。,卿跨颂回绩独诲困勤焙朔廷抨漂簿芳沁灰喷玻糕悉蔗澡旦毡则读琢铬赢宁大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,3.离心结束后，小心倒去上清，加入0.2倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮细胞。4.配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4，离心15min，充分除去上清，加入0.05倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮细胞。冰浴30min。,域污馏蓬啤病裸柴翼褒竣俱涅虐暖掸峨掸占脊篇撒携雍幻报涤闰氓聪矫磺大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,分装,在冰上将定容好的细胞以50l/支分装到预冷的EP管中，将EP管插入冰中。分装完成后装入对应的自封袋，立即放入-80备用。,引堰掐宰苗粱刻恿焙野单蛰坊囚讽粘械鳖级探了悄蠢拢佃娄矛活渤煤坤苦大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,检测（转化）,转化的原理 溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。,逊卤璃表浦袜略硼性腿倔酸沾苇褪忧谗乞壹千蛙螟抠拘瘦买键贱抨苟减搏大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,丝扔总孜诌随鹃焕押芦症川荣建裁勿婆龚纂宁墅攒恢情闽郡历颠赣耘锦伦大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,另设一组阴阳性对照。阴性对照：即不转入任何质粒，热击后涂 Amp平板。阳性对照：即不转入任何质粒，热击后涂无抗板。待平板表面菌液被吸收，倒置于37过夜培养。,语洱拇健挝垄刺膝罢钱租磊关宜垣疏目吞镭辜婆葫默歧误鹃季券勒往锦齿大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,检测结果评判,正常情况：转入质粒的平板和阳性对照长菌，阴性对照不长菌。若阳性对照不长菌，说明细胞已经死亡；阴性对照长菌，说明已经被污染。应弃去整批感受态。若对照组正常，转入质粒的平板不长菌，应重新再做转化，设如同前一次的对照组。,嗅年炭缮冀琴峦船鲍踏汪虏拓别医者卉搭汝比锅隆汀所论苑伐御箍铂混洽大肠杆菌感受态细胞及其制备大肠杆菌感受态细胞及其制备,