药物分析课件第十一章抗生素类药物的分析文档资料.ppt

第一节 概述,抗生素的定义,抗生素的来源,1.生物合成（发酵）,2.化学合成或半合成,是指“在低浓度情况下对某些生物的生命活动有特异性抑制作用一类化学物质的总称”,抗生素质量的复杂性,化学纯度低,同系物多异构体多降解物多,发酵过程不易控制易受污染,工艺复杂，活性组分易发生变异,产品稳定性差,分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,抗生素类药物的质量分析,（一）鉴别试验1、显色反应特殊基团的反应2、光谱法特征吸收3、色谱法保留行为4、生物学方法抗菌能力,(二)检查,1、常规检查水份、酸碱度等2、有机和无机杂质检查3、异常物质的检查异常毒性、热原等4、其他检查其他共存组分,含量测定或效价测定,1、微生物检定法稀释法比浊法管碟琼脂扩散法抑菌圈灵敏度高、需用量少适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大,效价:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少,是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法,是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法,2、物理化学法 HPLCLC-MSUV容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少,1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照,仪器分析方法,分类（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类,一、结构与性质,A,B,头孢菌素类,A,B,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉定,头孢噻吩钠,头孢羟氨苄,酸性,性质,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,(5%头孢唑啉钠溶液 1824),头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,（三）,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,青霉素钠,头孢氨苄,（四）内酰胺环 的不稳定性,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,青霉素的降解途径,与含水量和纯度密切相关,青霉素的降解产物青霉素酶青霉噻唑酸强酸性环境青霉酸弱酸性环境青霉烯酸 强酸性-加热青霉醛 强酸性-加热/青霉素酶-重金属青霉胺,二、,鉴别,（二）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,头孢菌素类,3.茚三酮反应,-氨基,4.双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,5.与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,6.与重氮苯磺酸反应,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,7.与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,（三）沉淀反应,1.遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,青霉素的碱金属盐的溶解性,2.有机胺盐反应,（1）重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,（2）与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,样品、分解产物,头孢氨苄 max=262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm=1.301.50,-内酰胺环,酰胺,利用不同结构的原子核在D2O中有不同的NMR光谱进行鉴别,JP,以吸收峰频率对峰强度进行作图,主要研究原子核的磁化性质及其在外磁场中的运动规律,对照品对照法,三、杂质检查,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 头孢哌酮钠 头孢噻肟钠 头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法 头孢氨苄 有关物质 反相TLC法青霉素钾（钠）吸收度 紫外分光光度法,1.头孢他啶聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶G-10（40120m）流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B：水 对照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml,1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。N不低于900，拖尾因子0.751.5，峰面积的RSD应小于5.0%。2）测定方法 进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）1）头孢呋辛酯2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相 头孢呋辛酯2-异构体。2）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以 头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3）异构体：相对保留时间 1-被测物 2-标准物异构体 相对保留时间 判断B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应 为0.480.55。,异构体A,异构体B,头孢呋辛,3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二 钠-丙酮（120：80：3）供试液：本品 50mg/ml 对照液（1）：本品 0.5 mg/ml 对照液（2）：-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml,结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。,4.青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液 1.80mg/ml，结果判断：A280不得大于0.10,HPLC、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、可见紫外分光光度法等,（水解）,水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,反应分两步进行：1.水解反应(按化学计算量进行)2.氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),例,注射用普鲁卡因青霉素 含量测定,取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在2025暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，,至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致,（1）弱酸性 pH4.5,碱 I2 IO3-+I-,酸 普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀,（2）温度 2426,温度38 未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,原料,（水解）,青霉素族,碱性水解产物青霉噻唑酸，进一步水解产物青霉胺,样品,以未经水解的样品作空白测定,例,青霉素钠 含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录 A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，,（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按C16H17N2NaO4S计算)。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上.,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。,（1）以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点,（2）反应摩尔比 1:1,（3）空白试验 消除已降解产物干扰,（4）优点 不需标准品,精密称取含水量为0.5%的青霉素钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。,例,青霉素钠 含量测定,（钠盐）,-内酰胺类,-内酰胺环的不稳定性,中和,加NaOH中和,（1）水解前先中和溶剂和样品,（2）加热时避免吸收CO2,不能使酚酞变红,（3）空白试验校正(消除Na2CO3干扰),（四）可见-紫外分光光度法,原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在320 nm360 nm处有强烈吸收特性，并且该降解产物与Cu2+或Hg2+形成稳定并易于测定的配位化合物，从紫外分光光度法测定。硫醇汞盐法酸水解铜盐法羟肟酸比色法,（水解）,（1）原理,稳定剂,JP,青霉素族,酸性降解产物,（2）方法,H+,（3）特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,（1）原理,（咪唑）,青霉素族,催化剂,（2）方法,对照品法,pH 9,（3）讨论,a.咪唑催化的水解产率高，硫 醇汞盐稳定（3h）,b.侧链有-NH2时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述 反应,（4）特点,A、简便快速B、用标准品对照，重现性良 好，RSD1%,红色,-内酰胺类,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,哌拉西宁 原料药 含量测定色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。,生物样本中-内酰胺类抗生素的分析,血浆尿样唾液胆汁,生物样本,色谱柱：Hypersil ODS C18(200 mm4.6 mm,I.D.5m)样品制备：取血浆200L，加入内标5L，再加入HCLO4，窝旋提取,Internal standard IS,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素,一、结构与性质,链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉素：,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,多与硫酸成盐,碱性,（一）,巴龙霉素 4个,链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212,羟基胺结构,吡咯衍生物,樱桃红色,（Elson-Morgan反应）,链霉素特有反应,具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，加入 萘酚（红紫色）或蒽酮（蓝紫色）,（五）坂口反应链霉胍的特有反应 向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物1；8-羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物2。产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物。,H+,庆大霉素无UV吸收,（七）UV法,（八）色谱法 1、TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品 对照液：硫酸链霉素标准品+硫酸 新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品,判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液 相同，对照液应显示分离清晰的3个斑点 否则试验无效。2、HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留时间,三、特殊杂质的检查1、链霉素中链霉素B的检查TLC法硅胶G板（使用前需活化）、展开剂 甲苯-冰乙酸-甲醇（50:25:25）、0.2二羟萘的乙醇20硫酸混合液色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效,max=330nm,（1）衍生化原理,或电化学检测器或蒸发光散射检测器,RPHPLC,规定 C1 2550%C1a 1540%C2a+C2 2050%,峰面积归一化法,链霉素、庆大霉素,微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,第四节 四环素类抗生素,一、结构与性质,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,多含结晶水,pH3 7.5 荧光,酚羟基、烯醇基,差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,弱酸性环境,ETC,差向四环素,强酸性环境,ATC,脱水四环素,碱性下降解,（荧光）,碱性环境,EATC,异四环素差向脱水四环素,含有酚羟基,溶剂：1mol/L盐酸-甲醇浓度：0.01mg/ml,UV,具有共轭双键,正相分配薄层 色谱,加入EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,TLC法（1995版）,HPLC法（2005版）,标准品对照法,盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,杂质吸收度,HPLC法（外标法）,盐酸四环素的测定系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏,外源性杂质,内源性杂质,2、基本特点对青霉素而言,青霉噻唑多肽外源性的（24003500）青霉素聚合物内源性的（聚合度）母核参与的聚合反应N型聚合反应 侧链参与的聚合反应L型聚合反应,分类,特点：（1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质（2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3）异构体之间可以相互聚合L-L、D-D、L-D（4）高分子杂质与生产工艺密切相关,高分子杂质的控制方法,（1）高效液相色谱法（2）凝胶色谱自身对照外标法 Sephadex G-10（3）离子交换色谱,凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。,高分子杂质的分析方法,（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的 N2500/m，拖尾因子0.751.5（2）峰面积的RSD5,色谱适用性条件,HPLC系统简单测定系统,分析方法,