[工学]产壳聚糖酶菌株的筛选.doc

毕业设计（论文）开题报告理工类题 目: 壳聚糖酶产生菌的筛选 学 院： 海洋学院 专业班级： 生物工程 生工081 学生姓名： 查玉龙 学 号： 040822136 指导教师： 赵玉巧（教授） 2012年 3 月 2 日淮海工学院毕业设计（论文）开题报告1.课题研究的意义，国内外研究现状、水平和发展趋势(1) 课题研究的意义：远在几千年前本草纲目中早已有蟹壳粉的记录，可见古人早已将壳聚糖做为医疗之用。根据现代医学研究。壳聚糖是继蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后人体不可缺少又一生命要素，对人体健康有八大作用；壳聚糖是目前宇宙中发现的唯一带正电荷的阳离子食物纤维，与人体具有良好的亲和性。是现代病、常见病的克星，临床验证它对人体的健康有八大功能。 减肥调脂；美容护肤、靓丽容颜；强化免疫系统、抑制肿瘤；保肝护肝、防醉酒；防治糖尿病；防治高血压；促进肠道有益菌繁殖吸附；排出体内重金属。 (2) 国内外研究现状、水平：自1967年第一篇壳聚糖文献报道以来，国际上关于壳聚糖公开发表的研究论文专利接近3000篇，以日本、韩国及中国的文章专利报道居多。目前壳聚糖已在日本、韩国、美国、加拿大等国家应用于日常食品、保健品中。我国壳聚糖的研究开发虽起步较晚，但2000年后国内文献专利数量明显增加，壳聚糖产品种类数量快速增长，目前正处在快速发展阶段。国外对壳聚糖酶的研究已深入到分子水平，侧重于研究不同来源的壳聚糖酶的晶体结构与催化作用机理；国内对壳聚糖酶的研究日益增多，主要是从自然界中筛选产酶活性较高的微生物菌种，进行诱变选育，优化发酵工艺与酶解条件，以期获得产酶量较大的菌种和活性较高的壳聚糖酶。(3) 发展趋势： 壳聚糖是一种新材料，对人类社会的发展与进步有着巨大的作用。壳聚糖已应用于许多领域中，其中化妆品，保健品，食品工业等行业对壳聚糖的需求增长最快；在医药、化工、造纸、农业、环保、轻纺等领域中正在得到广泛的应用。淮海工学院毕业设计（论文）开题报告2.课题的基本内容，可能遇到的困难，提出解决问题的方法和措施(1) 课题的基本内容：调查并充分查阅资料预实验设计实验方案采样富集培养纯种分离斜面保藏复筛较优菌株斜面保藏复证菌株保藏。(2) 可能遇到的困难： 富集，初筛，复筛，复证培养基的选择。 纯种分离：平板划线时，分离不出单菌落。 测出酶活的大小不如意。(3) 提出解决问题的方法和措施： 调查和搜集各方面资料，多做预实验并咨询老师，调整不同的培养基。 确保无菌操作，掌握平板划线分离法，要多练多做。 积累前面取样的经验，找到富含目标菌种的样品源。3.课题拟采用的研究手段（途径）和可行性分析(1) 研究手段： Minoru Yabuki 方法制胶体壳聚糖； DNS测还原糖； 生产性能实验测酶活。 (2) 可行性分析： DNS测还原糖通过DNS显示剂与还原糖结合显色，测其OD值，显色与还原糖含量，OD成正比。 生产性能实验测酶活，通过测定酶活，鉴定菌种优良以及生产的可行性。 淮海工学院毕业设计（论文）开题报告指导教师意见（对课题的深度、广度及工作量的意见和对设计结果的预测）指导教师（签名） 年 月 日系审查意见：系主任(签名)： 年 月 日毕业设计(论文)外文资料翻译学 院： 海洋学院 专业班级： 生物工程 生工081 学生姓名： 查玉龙 学 号： 040822136 指导教师： 赵玉巧(教授) 外文出处：Process Biochemistry 43 (2008) 132-138 附 件：1.外文资料翻译译文； 2.外文原文 指导教师评语：签名： 年 月 日从纳豆激酶产生菌TKU007提取出的壳聚糖酶的分离纯化及性质研究摘 要：从以对虾壳为唯一C/N源的Bacillus subtilisTKU007菌的培养上清液纯化出来的一种表面活性剂稳定的胞外壳聚糖酶。TKU007壳聚糖酶受到纳豆激酶的抑制，这种抑制作用出现在第一天。用SDS-PAGE和凝胶过滤法测得TKU007壳聚糖酶分子质量分别为25kDa和33kDa。这种酶的最适pH、最适温度、pH稳定范围以及热稳定性分别为pH7、37、pH 49以及37。TKU007壳聚糖酶第226个氨基酸到第229个氨基酸与B.Subtility D gamma- DL-glut-amyl水解酶的氨基酸序列相似，该酶的氨基酸序列与B.Subtil-is纳豆激酶的氨基酸序列相似。关键词：Bacillus subtilisTK；壳聚糖酶； 纳豆激酶简介在加工的过程中对虾的头部、外壳以及尾部被去除并且这些质量占了虾的50，由于无节制的堆积，随着不可食部分的增加，这些正在造成环境的污染。因此，为了处理上述问题，生产出虾的副产品必须得以关注。通过利用几丁质和干贝壳中的蛋白质，工业加工虾过程可以使经济分别从14增加到32，从18增加到42。甲壳类材料的生物转换已经被提议作为甲壳类动物废料处理的手段。为了进一步提高对海洋中甲壳类动物废料的利用，最近我们研究了甲壳类废料的生物的转化，进而产生一种蛋白酶式壳聚糖酶。为了获得有用的碱性蛋白酶式壳聚糖酶，我们成功的分离出了一些嗜碱菌，这种菌通过利用以对虾壳作为唯一C/N源，可以产生胞外蛋白酶式壳聚糖酶，这些酶中有一种TKU007的细菌，在培养液上清液中第二天可以最大地产生且有表面活性剂的和溶解稳定性的碱性蛋白酶，壳聚糖酶的活性出现在培养基第一天，而随着蛋白酶活性的出现而消失。壳聚糖酶已经在各种细菌包括在芽孢杆菌中发现。在这些已经公布的壳聚糖酶产生菌中，没有发现一种可以同时产生纳豆激酶和壳聚糖酶的菌株。因为由于随着蛋白酶的出现，壳聚糖酶的消失，因此，在本论文中，我们尝试使用对虾壳粉作为廉价的C/N源来优化TKU007的培养条件，让其最大量生产壳聚糖酶。此外，这种新的壳聚糖酶再此研究中也可以纯化、描述并且与从其他菌中产生的壳聚糖酶进行比较。材料和方法材料如前所述，鱿鱼粉（spp），虾壳粉（asp），蟹壳粉（sc sp）用于这些实验的准备，鱿鱼粉、虾壳和蟹壳从 Shin-Ma Frozen Food Co. (I-An, Taiwan)购买，KM和KB 从Ai-Cu Food Co. (I-An, Taiwan)购买。在spp、asp和sc sp的准备过程中，鱿鱼、虾壳和蟹壳先用自来水冲洗干净，然后烘干。干燥的原料磨成粉末作为C源来生产蛋白酶。来自CFSS和CFCS的几丁质从 Biotech Co. (Eau-squooshy, Taiwan)，溶解性壳聚糖（82脱乙酰度）从Penwell Biotech Co.(Tau-Tyumen, Taiwan)获得。几丁质粉末从Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)购买。胶体壳聚糖按照 Jennerian的方法从粉末壳聚糖制取。 DEAE-Agarose CL-6B和Acrocephaly S-100从Amer sham Pharmacy Biotech AB (Uppsala,Sweden)购买，所有其他试剂用最高等级的。方法菌体和酶的生产TKU007是一种蛋白酶产生菌，从台湾的土壤中分离出来并且在37营养琼脂平板上生长。在已知的培养条件中，该菌可以在包含0.1KHPO 4 和 0.05 MgSO4.7H2O (pH 7)，并且补充0.5-2的碳源的基础培养基上生长，碳源包括SPP、SSP、SCSP、CFSS、KM、KB和酪蛋白。100ml的组合培养基放在250ml的锥形瓶中，在有氧的条件下，摇床（150rpm）培养1-5天。然后在4、12000r/min离心20分钟后，上清液收集用来测量酶活。壳聚糖酶的纯化壳聚糖酶的产生为了产生壳聚糖酶，将TKU007在200ml的液体培养基中生长，该培养基成分包含1.5SSP、0.1K2HPO 4、0.05MgSO4.7H2O (pH 7)，两毫升的种子液注入到200ml的培养基中，30在pH 7摇床培养一天。然后将培养液在4、12000r/min离心20min，上清液用色谱分析进一步提纯。阴离子交换树脂管柱（DEAE-色谱分析）；CL-6色谱分析将（608g/L）(NH4)2SO4加入上清液中，混合液在4下放置一夜，然后在4、12000r/min离心20min，并且形成沉淀该沉淀物通过离心收集起来。然后将沉淀物溶于50mm的磷酸钠缓冲液，并在缓冲液中透析。将透析液上柱，并与pH7的磷酸盐缓冲液平衡，如图一所示，壳聚糖酶被洗掉并且在包含NaCl缓冲液的柱中重新测得，通过(NH4)2SO4沉淀，高酶活部分结合并集中到了一起。通过离心分离收集沉淀物，并将其溶于50mm的磷酸钠缓冲液（pH7）。葡聚糖凝胶S-100层析法将生成的酶液加到葡聚糖凝胶S-100凝胶过滤柱，并且与50mm的磷酸钠缓冲液（pH7）平衡，然后用同样的缓冲液洗涤，这样就得到壳聚糖酶活性的一个高峰，组合，作为纯化制备C1。蛋白质测定蛋白质含量可以用Bradford法测定，通过BioRad染色剂浓缩，并且用牛血清蛋白作为标准，柱层析法后，通过测定280nm吸光度来估测蛋白质浓度。酶活的测定壳聚糖酶活性测定以壳聚糖为底物，将0.5毫升酶液加入1.0毫升的底物溶液中，其中包括0.2（pH7溶于50mm的磷酸钠缓冲液）的胶体壳聚糖。混合液于37培养30min，离心后，上清液中还原糖的量用 Imoto 和Yagishita方法测得。其中Yagishita以氨基葡萄糖作为参考。一个酶活力单位定义为每分钟催化1mmol酪氨酸的酶量。分子量的测定纯化的蛋白酶分子量用SDS-PAGE测定。标准蛋白使用磷酸化酶（b）（分子量97.4kDa），清蛋白（66.2kDa），卵清蛋白（45kDa），碳酸酐酶（30kDa），胰蛋白酶抑制剂（20.1kDa）和-乳清蛋白（14.4kDa）作为标准。在电泳之前，蛋白暴露在含有-m的10mm磷酸盐缓冲液中一夜。凝胶剂在甲醇-乙酸水溶液中被考马斯亮蓝R-250染色，并被7醋酸脱色。TKU007壳聚糖酶分子量通过凝胶过滤测定，样品和标准蛋白被应用于葡聚糖凝胶S-100柱与50mm磷酸盐缓冲液平衡。牛血清蛋白一分子量67kDa，芽孢杆菌属-淀粉酶（50kDa）和鸡蛋清溶菌酶（14kDa）作为分子质量数指示器。氨基酸序列测定纯化的酶通过SDS-PAGE分离并且依靠印记转移到聚乙二烯二氟化物膜上。模糊蛋白从膜上剪掉，并且应用生物系统491蛋白测序模型进行N-末端氨基酸序列测定。结果与讨论培养条件和酶的产生为了讨论通气率对壳聚糖酶产生的影响，在我们初步的试验中，我们发现200ml的基础培养基0.1K2HPO 4、0.05MgSO4.7H2O (pH 7)包含1.5SSP在30更有利于TKU007菌株产生壳聚糖酶。为了研究C/N对壳聚糖酶产生的影响，在200ml的基础培养基包含额外的C、N源。分别为0.5-2的SPP、SSP、SCSP、CFSS、KM、KB和酪蛋白。在30培养1-5天。结果表明1.5SSP（0.03U/ml，1天）是 最适合作为壳聚糖酶产生的诱导物，换句话说，200ml包含1.5SSP的基础培养基于30培养一天，是TKU007菌株产生壳聚糖酶很好的培养条件。结果表明，壳聚糖酶和几丁质酶最大的酶活都出现在第一天，并且从那以后随着蛋白酶的出现，活力在显著地降低。为了研究壳聚糖酶的活力随着蛋白酶出现而降低的原因，TKU007分别培养在壳聚糖酶和蛋白酶产生的最适条件下。TKU007在150r/min摇床培养，100ml两天（为了蛋白酶产生）；200ml一天（为了壳聚糖酶产生）。通过TKU007的上清液，我们检测蛋白酶和壳聚糖酶的活力，相同量的蛋白酶和壳聚糖酶液混合在一起，并在37分别反应0、15、30、60min。结果如表1所示，反应60min后，蛋白酶保留了71活力。但是，壳聚糖酶活力只有23。以此来推测壳聚糖酶活性下降原因。可能是该壳聚糖酶的热不稳定性。用50mm磷酸盐缓冲液来替代蛋白酶，并且与壳聚糖酶于37反应60min。结果表明，壳聚糖酶仍然保留68的活力。因此，可以推知，蛋白酶对壳聚糖酶的水解作用是该酶活性下降的主要原因。如果壳聚糖酶可以被蛋白酶以任意内切形式降解，这时它就可以用SDS-PAGE检测。因此，蛋白酶和壳聚糖酶反应液的任意反应时间用SDS-PAGE分析。结果并不能显示蛋白质分子量的任何重大改变。以上结果表明，蛋白酶可以外切水解壳聚糖酶N-末端和C-末端其他部位，并且引起壳聚糖酶活力下降。与这个研究相似，B. subtilis IMR-NK1也是蛋白酶和壳聚糖酶产生菌株，由于恢复产量要低于纯化的壳聚糖酶，作者推测蛋白酶的水解作用引起壳聚糖酶活力下降。在进一步纯化壳聚糖酶之前，用100ml上清液作为初步实验的样品来调查包含壳聚糖酶和蛋白酶在DEAE-Sep上的吸附作用。这两种上清液A(蛋白酶)和B(壳聚糖酶)，依据以上规定的最适条件都能产生。结果如表2所示，蛋白酶不能被DEAE-Sep吸附，然而壳聚糖酶可以被DEAE-Sep吸附。换句话来说，通过DEAE-Sep，两种酶可以有效的分开，并且恢复的壳聚糖酶量可以高达69，因此，DEAE-Sep用于TKU007壳聚糖酶纯化的进一步研究。分离和纯化从上清液中纯化的TKU007壳聚糖酶在第二部分得到描述。如表3所示，纯化的步骤结合起来，可以纯化17.2倍。纯化酶总体上活力产量达到48，特定的酶活力为0.0603U/mg。最终获得TKU007壳聚糖酶量为680mg，纯化的酶用SDS-PAGE也被证实是均质的。TKU007的分子量用SDS-PAGE和凝胶电泳分别测得是25kDa和33kDa。如图二。TKU007壳聚糖酶分子量与其他杆菌壳聚糖酶有明显的不同，如：B. subtilis IMR-NK1 (41 kDa)、B. cereus S1(45 kDa)、B. ehimensis EAG1 (31 kDa)、B. Megaterium P1 (43, 39.5, 22 kDa)、Bacillus sp. KCTC0377BP (45 kDa)、Bacillus sp. MET1299 (52 kDa)、Bacillus sp. 739(46 kDa)、Bacillus sp. P16 (45 kDa)和Bacillus sp. 7-M (41 kDa)、B. subtilis GM9804(27 kDa)、B. subtilis KH-1 (28 kDa)和Bacillis sp.DAU101 (27 kDa)壳聚糖酶是唯一产Bacillus壳聚糖酶菌株，它们与B. subtilis TKU007有相似的分子量。pH和温度对酶活的影响在标准实验条件下，通过使用溶解性壳聚糖作为底物来研究pH对催化作用的影响。pH7时酶活性达到最大值，在不同pH值下37培养60min后通过测定pH7时剩余酶活来测定壳聚糖酶活的pH稳定值，壳聚糖酶的活力在pH4-9。（如图3） 通过以可溶性壳聚糖作为底物来研究温度对壳聚糖酶活性影响。TKU007壳聚糖酶的最适温度是37，为了研究TKU007壳聚糖酶的热稳定性，在pH7、50mm磷酸盐缓冲液中的酶液在各种温度下放置60min。然后测定残存的酶活，在25到30，TKU007壳聚糖酶保留原始的酶活，在37时，有60的活力，但是在60完全失活。（如图4）各种化学制品对酶活的影响为了进一步研究TKU007壳聚糖酶的生化特征，下面我们研究一些已知酶的抑制剂和二价金属对酶活的影响。通过在50mm磷酸盐缓冲液用化学制品于37预培养10min,并且通过使用溶解性壳聚糖作为底物来测定残存酶活，来研究各种化学制品对酶活的影响，结果表明TKU007壳聚糖酶可以被5mMCu2+完全抑制,如表四所示，相似的结果在Bacillis sp.DAU101 壳聚糖酶中也有发现。各种表面活性剂对酶活的影响通过往反应液中加入表面活性剂往往使酶失活，研究不同表面活性剂对纯化的TKU007壳聚糖酶稳定性的影响。纯化的壳聚糖酶与表面活性剂于25培养60min，并且在正常分析条件下仍然很有活力。没有任何表面活性剂的壳聚糖酶样品酶活达到100（0.063U/ml）。据发现，即使存在2土温20、土温40和Triton X-100，TKU007壳聚糖酶活力也能分别保留48、96和91。对于阴离子去污剂SDS，TKU007壳聚糖酶活力在加入0.5mM和2mM的SDS之后，分别下降到65和9。（如表4）有机溶液的稳定性在反应液中加有有机溶剂酶往往失去活性，研究不同有机溶剂对纯化的TKU007壳聚糖酶稳定性的影响。加有机溶剂的壳聚糖酶在4和25培养10天，并且在正常检测条件下来测定剩余的酶活，未加有任何有机溶剂的壳聚糖酶样品的酶活100。如图5所示，TKU007壳聚糖酶的活力在加有甲醇、丁醇、甲苯、异戊醇和乙腈时于25培养10天后分别为134、100、160、150。这种稳定性使这种壳聚糖酶被应用于有机溶剂，来变换壳聚糖的水解和合成反应的平衡。N-末端氨基酸序列TKU007壳聚糖酶和蛋白酶通过SDS-PAGE移换到PVDE膜上，并且蛋白质通过Edman降解排序。壳聚糖酶氨基酸末端序列是XPQNI，纳豆激酶的是AQSVPYGISQIKAPALHSQG，这里X指的是为鉴别的氨基酸残基，与数据库中的序列相比，TKU007壳聚糖酶与B.subtilis ywtD水解酶的第226229个氨基酸最为相似。如表5所示的蛋白酶结果，与表中其他的酶相比较，所有的这些都与TKU007蛋白酶有相似的序列。TKU007蛋白酶与B. Subtilis纳豆激酶最为相似。依据标准纳豆激酶活力的测定方法，即以Nsuccinyl-ala-ala-pro-phe- p Na作为底物，也可测定TKU007蛋白酶和纳豆激酶的活力，结果表明，TKU007蛋白酶有纳豆激酶的活性。与其他报道过的Bacillus sp.壳聚糖酶、蛋白酶产生菌株不同，本研究的目的在于微生物对虾类废物加工的利用。以虾类作为单一的C/N源，来筛选壳聚糖酶或纳豆激酶产生菌。因此，虽然与报道过的IMR-NK1、GM9804、KH-1、DAU101壳聚糖酶产生菌一样，TKU007属于B. Subtilis，但是它部分的性能（如最适温度和溶解性）是不同的，与其他B. Subtilis壳聚糖酶产生菌不同，这些菌使用几丁质或壳聚糖作为C源，TKU007使用1.5虾类粉作为唯一的C/N源来产生壳聚糖酶或纳豆激酶。TKU007培养基更加简单和便宜。考虑到生产成本和生物资源的重复利用。使用TKU007在微生物收复食品等废弃物，比如废弃的虾壳来生产壳聚糖酶和纳豆激酶，保健食品以及生物肥料等。这就提供了有前途的研究前景。结论本次研究使用虾壳粉做为唯一C/N源来生产壳聚糖酶和纳豆激酶，这与其他绝大多数壳聚糖酶产生菌即使用壳聚糖作为C/N源不同。尽管TKU007的酶活力还是远远低于Bacillussp. strain KCTC0377BP。但这种壳聚糖酶产生菌只有自己的优势，因为虾壳是一种廉价的水生动物加工废料。并且它的发酵产品包括有功能的纳豆激酶，在保健品上的应用有研究的价值。本 科 毕 业 设 计 (论 文)壳聚糖酶产生菌的筛选Screening of Chitosanase-producing strain学 院： 海洋学院 专业班级： 生物工程 生工081 学生姓名： 查玉龙 学 号： 040822136 指导教师： 赵玉巧（教授） 2012 年 6 月毕业设计（论文）中文摘要壳聚糖酶产生菌的筛选摘 要：从连云港四个采样点共采了八十份土样，利用富集液体培养基和初筛培养基共筛得50个单菌落（壳聚糖酶产生菌）。经酶活测定后，有十株具有较高的酶活，最高的达到476U/L，经复证培养基培养后，酶活最高达到了2078U/L。现对SPG1-1进行形态观察：菌株SPG1-1为革兰氏阴性菌，直杆状，无芽孢，大小约为0.51.0m × 1.53.0m，根据对菌株SPG1-1的形态特征观察，该菌株与伯杰细菌鉴定手册中假单胞杆菌的分类特征最相符，所以初步判定菌株SPG1-1为假单胞杆菌属Pseudomonas.。关键词：土壤细菌；壳聚糖酶；筛选 毕业设计（论文）外文摘要Screening of Chitosanase-producing strainAbstract: Gathering the soil sample of 80 from LianYungang four sampling points,using liquid enrichment medium and early screening medium sieve 50 single colonies(chitosanase-producing bacteria).After the enzymatic activity determination,ten strains has higher enzyme live and the highest up to476U/L,after strenuous card culture medium develop,the enzyme live improve to2078U/L. From the morphological characteristics,Strain SPG1-1 Gram-negative bacteria,straight rods,no spores,About the size of 0.5 1.0 m×1.5 3.0m,According to the strains of SPG1-1 morphological characteristics,The strain and" the appraisal manual the bacteria berger" form afterbirth fungus of classification feature of the most consistent initially determined,so-for the strains SPG1-1 form afterbirth fungus of Pseudomonas.Keywords: Soil bacteria; chitosanase; screening目 录1 绪论12 材料和方法32.1 试剂32.2仪器 42.3胶体壳聚糖的制备42.4选择不同脱乙酰度的壳聚糖42.5确定培养基的成分42.6样品采集与培养基52.7分析方法63 菌株的筛选74 菌体的观察 115 菌种甘油保藏11结论 13致谢 14参考文献15附表清单：表1 试剂及生产厂家 3表2 仪器名称及厂家4表3 标准曲线测定方法7表4 第一批样品（3月23日）7表5 第一批酶活测定数据8表6 第二批样品（4月4日）8表7 第二批酶活测定数据9表 8 第三批样品（4月22日）9表9 第三批酶活测定数据10表 10 第四批样品（4月45日）10表 11 第四批酶活测定数据10表 12 初筛结果与样品地点分布结果10表13 复证酶活测定数据11淮海工学院二一二届本科毕业设计（论文） 第 15 页 共 15 页 1 绪论近年来，国内外研究发现低聚壳聚糖具有更好的溶解性，吸收性，尤其应用于女性化妆品，食品中的保健品，以及农业等生活各方面有着明显的效果和广泛的应用。由于壳聚糖较难降解，需要找到一种能够降解它的酶，不然我国大量的壳聚糖将会被浪费。而传统的将甲壳素脱乙酰制得的壳聚糖经过酸解生成低聚糖的方法效率低，收率低。而专一性水解壳聚糖的酶壳聚糖酶不仅解决了传统方法的弊端，而且效率，水解率大大增加，为工业大规模化生产提供了可能和希望。1.1 壳聚糖及其结构特点壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，主要存在于虾等动物外壳以及菌类的细胞壁中1。一般而言，N乙酰基脱去55%以上的就可称之为壳聚糖，这种脱乙酰度的壳聚糖能溶于1%乙酸或1%盐酸，因此，凡是能溶于1%乙酸度或1%盐酸的甲壳素都可称之为壳聚糖。作为有使用价值的工业品壳聚糖，N乙酰度必须在70%以上。下图是它的化学结构2：图1 甲壳素、壳聚糖分子的化学结构示意图1.2 其微生物来源3这种酶分布广泛，目前已从细菌(Bacillus、Myxobacter、Enterobacter)、放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(Aspergillus、Penicillium)、病毒(chlorella virus PBCV一1、CVK一2)及植物的不同组织中检测到它的存在。1.3 壳聚糖的性质、分类壳聚糖酶最初分为2类，但Fukamizo等4提议细分为3类，即壳聚糖酶I、壳聚糖酶、壳聚糖酶。壳聚糖的结构和纤维素类似，现在不同来源的壳聚糖因为他的原料和制作的方法不相同，所以，不相同的产品有着不相同的脱乙酰度，而这个结果也必然会影响到产品的性质，同时也决定了不相同的商品只能适用于某些地方。1.4 低聚壳聚糖当今应用现状自然界存在着大量的具有生活活性的糖类化合物资源。以虾蟹壳为原料，经过脱钙、脱蛋白、脱色及脱乙酰基反应后，运用酶生物技术和先进分离技术制备而成的壳寡糖产品，具有水溶性好、生物活性高、功能作用大、应用领域广、易被人体吸收等突出特点。由于壳寡糖具有许多特殊的理化性质，如能与生物体细胞有良好的生物兼容性，无毒，易被生物体所分解，以及生理功能而被广泛地应用于医药卫生、保健食品、食品加工、化妆品、纺织、环保、农业、饲料、环保等领域。1.4.1 壳寡糖在医用领域中的应用5壳寡糖在医药领域具有多方面的生物活性，在预防和治疗多种疾病中具有巨大的应用潜力。早在1985年Suzuki等6就做实验得到很好的效果的；1997年，国内学者又用低分子壳聚糖口服液对临床患者进行辅助治疗，发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，T细胞的数量显著上升，这也说明了低分子壳多糖的抗肿瘤辅助疗效。因此，它可作为早期的肿瘤的治疗药物。目前的细胞水平实验表明壳寡糖对很多种肿瘤细胞都有杀伤作用。1.4.2 壳寡糖在保健领域中的应用寡糖在医疗保健领域具有巨大的需求空间，随着人们生活水平的提高，食品功能化的发展趋势势在必行，寡糖在保健品领域的应用已经得到广泛的认可。壳寡糖在机能性食品上的应用最受到瞩目，其具有多项生理调节机能，包括调节人体免疫力，改善消化吸收功能，降低脂肪及胆固醇摄取，降低高血压，防止老化，成年病，肥胖病，促进双歧杆菌增殖，消除疲劳，促进钙的吸收，调节生理机能及吸附体内重金属等。目前寡糖主要应用于食品领域，全球功能食品市场总值过400亿美元.壳寡糖具有低甜度，低热值，低粘度等特性，所以被广泛应用于各类保健品，饮料及奶制品中。1.4.3 壳寡糖在农业等领域中的应用将壳寡糖制作成为农药是一种新型产物，具有无毒害、不污染环境、兼有药效和肥效双重生物调节功能的特点，可诱导激活植物免疫系统，提高植物抗病毒能力。由于经常打农药，这样就会使得害虫的生存能力更强，以前的农药打得越多，这样就会更严重的破坏环境还有使得我们社会。壳寡糖能很好的维护健康，且有具有很多优势，可以给农夫带来巨大的效益，所以把它应用于这方面，来取代以前的劣势产品，这样将会得到意想不到利益7。所以它在这的应用对我国的农业可持续发展具有重要意义。1.4.4 壳聚糖的用途（1）壳聚糖很好的应用于化妆品方面8：壳寡糖来源于生物提取物，其特殊的分子结构决定了壳寡糖具有很多的优势性能，它可以很好地避免化妆品给皮肤带来的副作用，而使其很好的替代化妆品。从而应用于这个领域，将会是这种产品引来新一轮旋风。很多国家已经将它应用于这种产品，并且取得很好的效果，相信这将是世界的一个潮流，并且能够促进经济的发展9。（2）壳聚糖在保鲜中的应用：蒋挺大（1995）研究壳寡糖中含有大量的NH2和OH，可与多种金属离子形成配合物。脂肪食品中若含金属离子，则会对脂肪自动氧化起加速作用。另外，与脂肪食品中的活性氧发生反应，清除掉引起氧化反应的活性氧。壳寡糖具有良好的水溶性，可以与鲜肉中游离脂肪酸充分接触，形成稳定的化合物，该复合物又可与几倍于其体积的脂肪结合，形成稳定的结构。这样，壳寡糖通过结合游离脂肪酸而起到抗脂肪水解的作用。1.5 国内外壳聚糖应用的未来趋势壳聚糖现在在全世界有着很大的生产量，并且都得到了各个国家很好的支持。相信只要这种产品能够真正的为人类带来生理，经济上的好处，人们就会更大量的来消费它，这样它就会为这个行业带来更大的消费动力10。壳聚糖在国际市场上供不应求，很多国家的年生产量都达到了几百万甚至是几千万吨，而这些量有超过一半是用来满足自己国家的消费需求。由于国际市场壳聚糖需求趋旺，日本和美国等从我国大量购买壳聚糖粗品，生产壳聚糖精品和壳聚糖衍生物，再以高科技产品返销我国，成倍获取利润。然而国内壳聚糖的生产正处于起步阶段。十五年前我国的年生产量在一、两百万吨。然而这几年我国对它的需求旺盛，各行各业都急需这种原料来生产产品。另外壳聚糖在很多重要的行业中，如：保健，环保等有着不可替代的作用。这几年对他的需求更是高涨不止，并且国内的生产量也是不断增长，这几年国内的需求量达到了几千万吨，实在是很大的需求量，前景非常乐观11。1.6 本实验的基本内容 调查并充分查阅资料预实验设计实验方案采样富集培养纯种分离斜面保藏复筛较优菌株斜面保藏复证菌株保藏。本实验从土壤中采集样品，取表土十公分处的土壤，既满足了低温，高压力，而且又是好氧菌的要求。通过富集培养基和初筛培养基两次筛选，液体摇瓶复筛，测定酶活，最后鉴定菌种。2 材料与方法2.1 试剂 表1 试剂及生产厂家试剂生产厂家蛋白胨国药集团化学试剂有限公司酵母膏国药集团化学试剂有限公司牛肉膏北京奥博星生物技术有限责琼脂中国医药（集团）上海化学试剂有限公司 氢氧化钠上海化学试剂有限公司盐酸徐州市科翔化学试剂有限责任公司粉末壳聚糖国药集团化学试剂有限公司溶解性壳聚糖国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钾南京化学试剂一厂磷酸二氢钾南京化学试剂一厂无水硫酸镁国药集团化学试剂有限公司乙酸钠固体国药集团化学试剂有限公司冰乙酸国药集团化学试剂有限公司DNS自配氯化钠南京化学试剂厂葡萄糖国药集团化学试剂有限公司硫酸铵国药集团化学试剂有限公司冰乙酸徐州试剂总厂2.2 仪器表2 仪器名称及厂家名称 生产厂家立式压力蒸汽灭菌器上海华线医用核子仪器有限公司SW-CJ-ICU超净台 苏净集团安泰公司SPX-150C型培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂HW.SY型电热恒温水浴锅浙江舟山市定海区海源医疗设备厂BP221S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统医疗设备厂HZQF160全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司SPX250BZ型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂HZQX100振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司TGL-16M高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心仪器有限公司 冷冻离心机 法国 Term