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糖 酶（Carbohydrases),应用淀粉食品加工糖工业发酵工业果蔬加工,糖酶的作用,(1)水解：大分子多糖小分子寡糖或单糖；(2)转糖苷作用：催化糖单位结构上的重排 产生新糖类化合物(3)作用于酯化的糖类,常见糖酶的种类,淀粉酶乳糖酶纤维素酶果胶酶,淀粉酶,催化淀粉、糖原和糊精中糖苷键水解的一类酶，属水解酶类。包括：-淀 粉酶、-淀粉酶、脱支酶、异构酶、葡萄糖淀粉酶、环状糊精葡萄糖基转移酶,由D-葡萄糖以-1,4和-1,6糖苷键连接的高分子物质。,淀粉,不同淀粉酶的水解方式,最终产物是。,小糊精,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶脱支酶,选择填空：小糊精-葡萄糖和极限糊精直链淀粉 葡萄糖,最终产物是。,-葡萄糖和极限糊精,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶脱支酶,选择填空：小糊精-葡萄糖和极限糊精直链淀粉 葡萄糖,最终产物是。,葡萄糖,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶脱支酶,选择填空：小糊精-葡萄糖和极限糊精直链淀粉 葡萄糖,最终产物是。,直链淀粉,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶脱支酶,选择填空：小糊精-葡萄糖和极限糊精直链淀粉 葡萄糖,-淀粉酶的性质（-Amylase）,命名：-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶 EC3.2.1.1，也称为液化酶。分布：植物：如玉米、稻米、高粱、谷子哺乳类动物：如人及动物唾液、胰液微生物：枯草杆菌、芽孢杆菌、吸水链霉菌、米曲霉、黑曲霉等,性质,分子量：约5万 金属酶：属于金属酶，每个酶分子中含有一个Ca2+，其与酶分子结合非常牢固。激活剂和稳定剂,(3)pH对-淀粉酶的影响,一般在pH5.58时稳定，pH4以下容易失活，酶的最适pH值为pH56。不同来源的-淀粉酶具有不同的pH特性 酶的最适pH 与 pH稳定性-淀粉酶最适pH值：黑曲酶为4.0；高梁芽4.8，小麦4.5左右从人的唾液和猪的胰脏的较窄6.07.0枯草杆菌得到的具有较宽广pH5.07.0嗜热脂肪芽孢杆菌的狭窄3.0左右大麦芽4.85.4,（4）温度对-淀粉酶活力的影响,-淀粉酶在40时活力最高，50以上容易失活，一些细菌来源-淀粉酶的最适温度为70。不同来源的-淀粉酶具有不同的热稳定性和最适温度。如果以每分钟升高1.5的速度加热-淀粉酶粗制剂的溶液，那么在温度达到80时，几种-淀粉酶的百分残余活力如下：霉菌1，谷类25，而细菌92。,耐热-淀粉酶,地衣形芽孢杆菌-淀粉酶的最适温度为，而淀粉液化芽袍杆菌-淀粉酶的最适温度为。,92,70,温度对酶的半衰期的影响,温度对-淀粉酶半衰期的影响 底物：31.5玉米淀粉，pH6.5,钙离子浓度,2.1.3.2-淀粉酶的性质（-1，4-葡聚糖麦芽糖水解酶 EC 3.2.1.2-Amylase),来源：高等植物：如小麦大麦芽、甘薯和大豆。微生物：如多黏芽孢杆菌等。哺乳动物无 通常是从大豆提取蛋白质后由废水中提取或从蒜苗制取淀粉的废水中得到的。麸皮、大麦、麦芽也是生产-淀粉酶的原料。微生物也是重要的原料。,-淀粉酶性质,（1）pH 对-淀粉酶活力影响植物：最适pH5.06.0 范围5.08.0微生物：最适pH6.07.0 范围4.09.0,（2）温度对-淀粉酶活力的影响,最适温度4060 不同来源的酶不同，微生物来源的耐热性优于植物来源的。大豆的在最适pH5.5时。65水解30min损失50，70水解30min可使酶完全失活。同样条件下，山芋粗酶在6065时不失活。大麦中的-淀粉酶的热稳定性低于-淀粉酶。,一、酶活力二、酶活力单位1.国际酶活性单位在最适条件下（温度可采用25或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1 min 催化1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位（IU）。,2.实用单位在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位-淀粉酶活力单位定义为:在60pH6.2条件下,每小时可催化1g淀粉所需要的酶量为一个单位（U).直接以光密度值表示：单位时间增加或减少0.001个光密度值为一个酶活单位（U)；例如溶菌酶、过氧化物酶 DNA聚合酶以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为三氯乙酸不溶物所需的酶量（U)；T4 DNA连接酶活力单位定义为：在20l反应体积中，16，30分钟内，将50%的Hind酶切的DNA片段重新连接起来所需的酶量（U)。,三、酶活力测定方法 终止反应法（Stopped method）连续反应法（Continuous method）,终止反应法将酶反应按时即刻完全停止，再确定产物的生成量或反应物的消耗量，算出酶活性。可以采用用酶法检测、化学检测、放射化学检测、光学检测、气体检测等生化检测技术。比色(光吸收)、滴定、气体体积度量等,常用的终止酶反应的方法：反应时间一到，立即取出适当反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸（TCA）等，使酶变性失活；加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值而使反应终止；将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至10以下而终止反应。,连续测定法基于反应过程中用仪器连续测定产物的生成量或底物的减少量（动力学法），算出酶活力。光谱吸收、电位、酸碱度、黏度、气体体积、热量的变更等 直接测定法 间接测定法 酶偶联测定法,酶法检测用其它纯酶将产物直接或间接转变成为分光光谱仪或荧光光谱仪测出的化合物。偶 联 法（coupled method）;指示酶（Indicator enzyme）,e.g.葡萄糖氧化酶活力 葡萄糖氧化酶葡萄糖 葡萄糖内脂+H2O2过氧化物酶（纯品）和木酚 过氧化物酶 H2O2+木酚 4-甲氧联酚 测A436nm 4-甲氧联酚的量 H2O2 的生成量 酶活力（葡萄糖氧化酶活力）,四、酶活力测定的条件与注意的问题1.反应时间 应选择在酶反应的初速度范围内通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的近似值2.酶量 必须和测得的活性有线性关系 3.底物 酶催化的专一性选择合适的底物和底物浓度。底物浓度应该大于5Km；一定浓度的底物溶液；均匀一致；达到酶反应所要求纯度使用的底物溶液；一般要求新鲜配制；预先配制后置于冰箱中保存备用；,4.反应条件 确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度和激活剂浓度等反应条件 温度 尽量保持恒定不变：反应应该在恒温水浴槽中进行 pH值 必须采用一定浓度和一定pH值的缓冲溶液 有些要求添加一定浓度的激活剂e.g.淀粉酶需要钙离子；,注意问题1.一定条件2.混合均匀3.准确计时4.设置对照,实验剖析淀粉酶活性的测定-淀粉酶 80保温20min 不耐酸在 pH值3.6钝化-淀粉酶 不耐热，在高温下易钝化将提取液加热到70保温15min以钝化-淀粉酶，便可测定-淀粉酶的活性；或者将提取液用pH 3.6的醋酸溶液在0下加以处理，钝化-淀粉酶，以求出-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将黄色的3，5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的浓度成正比，以标准麦芽糖做标准曲线，可求出麦芽糖的含量。以每克样品在单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。,-淀粉酶活性的测定（1）取4支试管编号，注明其中两支为对照管，两支为测定管。（2）于每管中各加酶液1mL，在700.5恒温水浴中加热15min，-淀粉酶因受热而钝化，取出后迅速冷却。（3）向对照管中加入4mL 0.4 mol/LNaOH，以使酶失活。（4）在4支试管中各加入lmL pH 5.6柠檬酸缓冲液。（5）将4支试管另置于400.5恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40下预热的1淀粉溶液2mL，摇匀后立即放入40水浴中准确保温5 min后取出，向各测定管迅速加入4mL 0.4mol/LNaOH溶液，终止酶活性。,+-淀粉酶活性的测定取4支试管编号，其中2支为对照，2支为测定管，各加入稀释酶液1mL及1mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。以下重复-淀粉酶测定的第(3)(5)的操作。-淀粉酶活性的测定,-淀粉酶活性麦芽糖(mg)鲜重(g)5min=(A)样品稀释总体积 样品鲜重(g)V（+）-淀粉酶总活性麦芽糖(mg)鲜重(g)5min=(B)样品稀释总体积 样品鲜重(g)V酶活单位的定义(以每克样品在单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。)U,延伸如何测定酶活力？测定酶活力应注意什么问题？测定酶活力在实际中的应用,淀粉酶在淀粉糖生产中的应用,产品种类,葡萄糖麦芽糖果糖低聚糖高果糖浆医药、食品、发酵行业自用糖（抗生素、味精、氨基酸等原料用糖）,-淀粉酶在淀粉糖生产上的应用,酶法生产葡萄糖的优点 糖化液没有苦味、葡萄糖纯度高、提高淀粉投料浓度、葡萄糖收率高,双酶法的基本工艺,淀粉,调浆,液化,糖化,脱色,过滤,离子交换,真空浓缩,结晶,分离,真空干燥,葡萄糖产品,液化机理,糊化,液化,(1)液化,液 化 方 法,升温液化：原料淀粉浓度：30%40%pH值：6.06.5 加入：-淀粉酶、CaCl2、NaCl 升温到：8590 保温：45min,采用喷射器,蒸汽和调配好的淀粉浆从不同的入口进入,利用蒸汽把形成薄层的淀粉乳瞬间上升到指定的温度,使之糊化、液化。喷射后再进入保温维持罐内维持一定时间喷射嘴温度：105110，保温维持缸温：9597，维持时间：1h左右。,喷射液化,地衣芽孢菌产酶能在110 以上利用！,糖化机理,淀粉产物,糖化酶水解,葡萄糖,方法,糊精,糖化酶,60 保温4048h,糖化液DE97%左右,升温80 以上,灭酶。,（2）糖化,冷却5560,调pH4.55.0,酶法制糖 酶法制味精酶法生产啤酒、酒精、白酒、黄酒酶法生产柠檬酸、抗生素、酶制剂,其他用途,葡萄糖异构酶,作用：催化D-木糖、D-葡萄糖和D-核糖等醛糖可逆地转化为相应的酮糖。,葡萄糖(醛糖）,异构酶,果糖（酮糖）,非水解酶,葡萄糖氧化酶,果葡糖浆,淀粉 葡萄糖 混合糖浆42%果糖 果糖 52%葡萄糖 葡萄糖 70%90%果糖6%低聚糖,液化糖化酶,异构酶,脱色精制浓缩,分离,异构酶,果葡糖浆,高果糖浆（HFCS),目前世界上淀粉糖的产量已达1000多万吨。其中一半是果葡糖浆,经典问题以支链淀粉（或玉米淀粉）为原料，制造果葡糖浆，需要哪些酶参加催化反应？,知识拓展-淀粉酶在真假蜂蜜鉴别的应用,乳糖酶（lactase)-半乳糖苷酶（-galatosidase),作用催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,性质 温度：来源不同而不同 2650 最适 pH：来源不同而不同 如酵母6.0,霉菌5.0,细菌 7.0 铁、钙离子有抑制作用 硫化物或亚硫酸盐有激活作用,应用1、低乳糖奶的生产,乳糖溶解度低，20 15%溶解，甜度低，以蔗糖100，则乳糖16，牛奶中乳糖占固形物30%。乳糖不能直接被小肠吸，产酸产气，引起腹泻。生活在亚洲一些地区的居民，由于体内缺乏乳糖酶而不能代谢乳糖，对牛奶有过敏性反应，乳糖不耐受症。,A、分离除去乳糖,低乳糖奶,B、加乳糖酶,乳糖,乳糖酶,葡萄糖+半乳糖,低乳糖奶 低乳糖奶粉 低乳糖咖啡奶、可可奶、果味奶等,生 产 方 法,炼乳、冰淇淋等乳制品，由于温度变化，常常有乳糖结晶析出，呈颗粒状结构，乳糖结晶析出，会促使酪蛋白凝聚，不合食用。水解 2530%乳糖水解可防止浓缩甜炼乳中其他糖的结晶。3040%乳糖水解可防止砂样结晶和蛋白质的絮凝。50%乳糖水解，在冰箱中保存4个月，乳糖也不结晶。方法：乳糖酶先分解脱脂牛奶，再制造冰淇淋。直接将乳糖酶加到冰淇淋配料中。,2、冰淇淋和冷冻浓缩牛奶的生产,（1）促进微生物的生产，某些微生物不能利用乳糖作碳源，水解后，可利用葡萄糖作碳源；（2）缩短酸奶的转化时间1520%（3）缩短鲜奶酪转化时间，形成的凝胶强度高，产率提高10%。,3、发酵乳制品,4、用于乳清的精深加工,5、用于半乳果葡糖浆的生产,6、在焙烤工业的应用,果胶酶,果胶质概念 由不同酯化度的半乳糖醛酸以-1,4糖苷键聚合而成的多糖链。常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链。游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起。沉积于植物初生细胞壁和细胞间层与纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些蛋白相互交联使细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态。,果胶结构,果胶类物质给食品加工工业中带来的难题,任何植物（水果蔬菜）都存在果胶果蔬的加工、储藏、运输榨汁中粘度大、汁得率低，过滤难。进入饮料中造成混浊沉淀、透光率不高番茄,果胶酶是分解果胶物质的多种酶的总称作用 催化果胶质分解来源,催化果胶解聚的酶,催化果胶分子的酯水解的酶,水解酶(EC3.),裂解酶(EC4.),聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG),聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL),聚半乳糖醛酸酶（PG),聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL),果胶酯酶（PE）,果胶酶,分类,1 聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）,水解果胶分子中的1,4-糖苷键，从而使果胶的粘度下降。内切PMG：使果胶粘度下降明显；外切PMG：使果胶粘度下降不明显。,聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果胶酯酶,寡聚甲基半乳糖醛酸D-甲基半乳糖醛酸或二聚甲基半乳糖醛酸,聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）,2 聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL）,切断果胶酸分子内部的1,4-糖苷键，生成具有不饱和键的相对分子质量较小的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降。,聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)果胶酯酶（PE）,寡聚具不饱和键的甲基半乳糖醛酸具不饱和键的甲基半乳糖醛酸，,聚甲基半乳糖醛酸裂解酶,果胶裂解酶,内切PGL具不饱和键,随机切断-1,4键,生成分子量较小的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降。,外切PGL,切断还原性未端-1,4键,具不饱和键的半乳糖醛酸，还原性增强，但粘度下降不明显。,果胶分子中的甲酯,PE,果胶酸+甲醇,3 果胶酯酶（PEEC:3.1.1.11),果胶酯酶促使果胶脱酯，生成果胶酸,聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果胶酯酶（PE）,CH3,CH3,果胶酸甲醇,果胶酯酶（PE）,内切酶（EC3.2.1.15）随机水解内部糖苷键，生成分子量相对较小的寡聚半乳糖醛酸。外切酶（EC3.2.1.67)从非还原性末端开始，逐个或逐二个水解1,4-糖苷键，生成D-半乳糖醛酸或二聚半乳糖醛酸。,4 聚半乳糖醛酸酶（PG）,水解果胶酸和其他聚半乳糖醛酸分子中的糖苷键。,聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果胶酯酶（PE）,H,寡聚半乳糖醛酸D-半乳糖醛酸或二聚甲基半乳糖醛酸,聚半乳糖醛酸酶(PG),H,5 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（PMGL）,果胶,内切-PMGL,随机切断-1,4糖苷键,分子量较小的聚甲基半乳糖醛酸，粘度下降；,外切-PMGL,从末端逐次水解-1,4糖苷键,具不饱和键的甲基半乳糖醛酸，粘度下降不明显。,聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)果胶酯酶,H,具有不饱和键的寡聚半乳糖醛酸具不饱和键的半乳糖醛酸,聚半乳糖醛酸裂解酶,H,果胶酶分布,霉菌中含各种果胶酶，裂解酶；细菌中主要为聚半乳糖醛酸裂解酶；高等植物中主要是果胶酯酶（PE)和聚半乳糖醛酸酶(PG)，不含果胶裂解酶。,番茄果中含PE，用基因工程技术使酶失活，转基因番茄中的酶含量不到普通番茄的1%，转基因番茄更耐挤压便于运输、制番茄酱的粘度明显提高。PG的作用果胶酯酶在降解果胶的同时会伴随着甲醇（CH3OH)的释出，这在制葡萄酒中应注意采用热处理。葡萄酒酿造过程中果胶酶的应用,在果蔬汁加工的过程中添加果胶酶减少提取的困难在果蔬汁加工的过程中添加果胶酶使果汁澄清果胶酶种类不同其作用方式也不相同苹果汁含有高度酯化的果胶，它易于被果胶裂解酶澄清，而单独使用内切-聚半乳糖醛酸酶几乎没有效果。如果采用内切-聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶混合酶制剂。当30%酯键和5%糖苷键被水解时，苹果汁就能达到完全的澄清。,果胶酶应用,1 果汁的提取和澄清 利于果汁的压榨，出汁率提高，经酶处理的果汁较稳定，可防止混浊。PG的专一性对果胶的酯化度要求不如PGL高 在澄清果汁方面往往注重以PG为主的酶组成 在提高浸出汁（特别是自流汁）方面往往注重使用以PGL为主的酶组成,2.果酒的澄清、过滤 苹果酒葡萄酒,3天然产物的提取,在适宜条件下,植物细胞会发生自溶也可产生包括果胶酶在内的分解酶类，但这会使待分离产物发生结构改变，甚至产生小分子副产物，因此，一般应先钝化胞内酶系，再有选择地进行酶处理。天然色素如葡萄紫、番茄红、等，中药提取物如银杏叶提取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、人参浆等均可使用酶法提取。利用酶提取,不仅可提高萃取率，还可提高纯度。,浓缩果汁在高糖浓度的条件下可自行凝结为果冻，但高糖对风味不好，且影响健康。通过PE处理，果胶的甲酯化程度下降,浓缩果汁,Ca2+、低糖浓度,PE,凝结果冻,要求PE中不含PG、PGL、PGML，以防果胶分解不结冻。,4低糖果冻的生产,5.带果肉食品的生产,一般常规加工所得到的果肉在必要的高温处理或机械泵出后，成型颗粒量明显减少,硬度降低，直接影响了产品品质。果胶质在PE作用下脱去甲氧基，在钙离子存在下形成凝胶，从而保持了果肉原有的形状和硬度。以此为基料的产品有果粒、果冻、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。,6.果实脱皮,橘子囊衣莲子肉皮大蒜膜层杏仁脱皮花生脱皮,7.果胶酶解产物具有生物活性,PG可水解细胞壁中的果胶成分产生寡聚半乳糖醛酸，它是植物防御反应的诱导因子。某些中草药中的药用成分也与果胶成分有关，如艾叶、柴胡根、人参叶、苍术根果胶酶解产物还具有抑菌活性，可显著抑制乳酸菌的生长；还可作为功能性食品的配料。,问题延伸生产澄清型果汁中如何正确合理使用果胶酶？,纤维素酶（cellulase),作用能降解纤维素-1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成葡萄糖的一组酶的总称是起协同作用的多组分酶系,分类,C1酶，纤维二糖水解酶（简称 CBH）（EC3.2.1.91）作用于纤维素线状分子末端，水解-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；Cx酶，-1,4葡聚糖酶（简称 EG）（EC3.2.1.4）作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；-葡萄糖苷酶（简称 BG）（EC3.2.1.21）将纤维二糖水解成葡萄糖分子。,来源,真菌、细菌、放线菌 原生动物、软体动物、昆虫植物,纤维素酶酶学动力学性质1.pH 最适pH4.510 酸性、中性、碱性2.温度 4560度 不同的测定温度 热稳定性 3.抑制剂、激活剂抑制剂：葡萄糖酸内酯，重金属离子（Cu,Hg），酚类物质（免受霉菌腐烂作用）激活剂：半胱氨酸酶活性测定方法,应用,1.果蔬加工中的应用 改进果蔬加工工艺大多数果蔬材料中含有纤维素，在果蔬加工过程中采用纤维素酶处理，可以使植物组织软化，改善口感，简化工艺。脱苦作用 葡萄糖苷酶作为风味酶 葡萄糖苷酶,2.在酿造工业的应用,酒精的生产酱油酿造啤酒工业食醋酿造,在日本清酒生产中浸米时加入 0.02%0.1%的纤维素酶，浸泡17h，米的溶解性好，糖化发酵顺利，酒渣少，出酒率高；纤维素酶在食醋酿造方面表明，添加纤维素酶产酒精量比 对照提高 7.5%23.8%，食醋产量提高0.251.38%，主料出品率提高5.127.2%；在酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精产率并缩短发酵时间。,3.纤维素酶在活性物质提取中的应用,在提取蛋白质、淀粉、活性多糖等物质时，用纤维素酶进行处理能提高产品得率。水解金针菇，可溶性多糖和可溶性固形物提取率显著提高，提取效果优于水煮法和浸煮法；对香菇柄和香菇盖中有效成分多糖和氨基酸进行提取，香菇柄加酶的提取液中多糖的含量比不加酶的增加 54%，香菇盖增加44%，而香菇柄加酶的提取液中氨基酸含量比不加酶的增加 10%，香菇盖增加15%；,其他糖酶的性质及应用介绍,蔗糖酶（转化酶）（EC3.2.1.26)环状糊精生成酶（EC2.4.1.19)木聚糖酶（EC3.2.1.8)-葡聚糖苷酶（EC3.2.1.73),