第三章芽孢杆菌生物学特性.doc

第三章 芽孢杆菌生物学特性第一节 芽孢杆菌形态特征一、概述芽孢杆菌属于细菌。从细菌的形态特征上看，有三种常见形状，即球状、杆状和螺旋状。分别称为球菌、杆菌和螺旋菌；杆菌最多，球菌次之，螺旋状细菌最少。球菌（coccus,复数为cocci），球状的细菌；据细胞的分裂面和子细胞分离与否有不同的排列状态，包括了单球菌（尿素微球菌）、双球菌（肺炎双球菌）、链球菌（酿脓链球菌、溶血链球菌）、四联球菌（玫瑰色微球菌、四联微球菌）、八叠球菌（藤黄八叠球菌）、葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）。螺旋状细菌（有人称为螺菌，spirillum,复数为spirilla）；螺旋状的细菌包括了弧菌（vibrio），螺旋不到一周，菌体呈弧形或逗号状，霍乱弧菌；螺菌，螺旋1-6周，外形坚挺的螺旋状细菌，红螺菌；螺旋体(spirochaete)，螺旋6周以上，由原生质柱、轴丝、外鞘组成，柔软易曲的螺旋状菌体；钩端螺旋体，梅毒密螺旋体。杆菌（bacillus,复数为bacilli）；杆状的细菌，形态多样，包括了短杆状，短杆菌或球杆菌（甲烷短杆菌属）；长杆或棒杆状，长宽差别较大（枯草杆菌、北京棒杆菌、白喉棒杆菌）；梭状，两端稍尖，（梭菌属：鼠疫巴斯德氏菌）；分支杆状，有分支（结核分支杆菌）；平截杆状：两端平截（炭疽芽孢杆菌）。特殊形状的细菌，菌体分叉，双歧杆菌；菌体末端有柄，柄杆菌；菌体有附器，臂微菌。细菌大小一般用显微测微尺测量，单位为微米（m）1m10-3mm10-6m。病毒多用纳米（nm）为单位，1m103nm。细菌的大小不一，球菌直径0.5-2m，杆菌1-5×0.5-1m，螺旋菌大小差别较大。大肠杆菌平均长2m，直径0.5m，150个大肠杆菌细胞头尾相接等于3mm长的一粒芝麻；120个大肠杆菌捆在一起才有一根头发粗细（人发平均直径60m），109个大肠杆菌才有1mg重。尽管芽孢杆菌形态简单，细胞大小差异也不很大，然而，芽孢杆菌的形态特征和细胞大小是分类学的重要特征，是芽孢杆菌分类单元的实物载体，研究芽孢杆菌生物学必须描述的内容。二、芽孢杆菌细胞形态芽孢杆菌属于耗氧菌，能耐酸、耐盐、耐高温。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶活性，还有平衡和稳定乳酸菌的作用。此类菌在动物肠道微生物菌群中仅少量存在。目前应用菌种是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。芽孢杆菌存在两种形态：芽胞和营养体。营养体的细胞基本形态有杆状和椭圆状。杆状中有长杆状、短杆状，椭圆状中有长椭圆和短椭圆，如下图。长杆状（Bacillus clausii）短杆状（Bacillus firmus）椭圆状（Bacillus endophyticus）Bacillus amyloliquefaciensBacillus benzoevoransBacillus cereusBacillus clausiiBacillus endophyticusBacillus firmusBacillus flexusBacillus gibsoniiBacillus lentusBacillus mojavensisBacillus pumilusBrevibacillus brevis三、芽孢杆菌芽孢形态1、芽孢的定义，有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在细胞一端，有的在细胞中部。由于芽孢是在细胞内形成的，所以也常称之为内生孢子，亦称芽孢。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。2、芽孢的形态，在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌，梭状芽孢杆菌的芽孢位于菌体中间。破伤风杆菌的芽孢位于菌体的一端，使菌体呈鼓槌状。好氧芽孢杆菌属(Bacillus)和厌氧的梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的所有细菌都具有芽孢。在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢. 细菌芽孢模式图3、芽孢形成，芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：核物质融合成轴丝状（杆状）。在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。在成熟的芽孢中，芽孢原生质体含有极高的吡啶二羧酸钙，在新合成的、具有特殊化学构造的外（皮层和孢子衣，有时还有芽孢外壁）中也有这种物质。芽孢的壁含有一种特殊的肽聚糖，所有芽孢基本上都一样，但与营养细胞的细胞壁肽聚糖却不一样。同时，芽孢中还含有一些特殊的蛋白质。4、芽孢的特性，由于芽孢在结构和化学成分上均有别于营养细胞，所以芽孢也就具有了许多不同于营养细胞的特性。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。同时，芽孢还有很强的折光性。在显微镜下观察染色的芽孢细菌涂片时，可以很容易地将芽孢与营养细胞区别开，因为营养细胞染上了颜色，而芽孢因抗染料且折光性强，表现出透明而无色的外观。研究表明芽孢对不良环境因子的抗性主要由于其含水量低（40）。且含有耐热的小分子酶类，富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和带有二硫键的蛋白质，以及具有多层次厚而致密的芽孢壁等原因。自由存在的芽孢没有明显的代谢作用，只保持潜在的萌发力，称为隐藏的生命。一旦环境条件合适，芽孢便可以萌发成营养细胞。细菌芽孢的特点概要，整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在光学显微镜下观察（相差显微镜直接观察；芽孢染色）。芽孢的含水率低，38%40%。芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（dipicolinicacid简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%15%。吡啶二羧酸，以钙盐的形式存在，钙含量高。在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。含有耐热性酶。芽孢由于有以上四个特点，是芽孢对不良环境如：高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在7080摄氏度时10分钟就死亡，而芽孢在120140摄氏度还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。芽孢不易着色，但可用孔雀绿染色。5、芽孢的耐热机制，渗透调节皮层膨胀学说：芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差皮层的离子强度很高，产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，具极强的耐热性。6、芽胞的萌发，刚形成的芽孢总是处于休眠状态。热处理（如65放置几十分钟）可以使芽孢加速活化。低温贮藏也有活化作用，只是较慢。芽孢萌发时首先发生吸胀作用，随之折光性和抗性丧失，继而呼吸作用开始，显出代谢活性，芽孢物质（干重）的30变为可溶物释出，营养细胞壁迅速合成，最后，新形成的营养细胞从孢子衣里萌发出来。萌发通常有三种方式：赤道脱出，末端脱出，斜出。7、芽孢的本质，芽孢细菌的繁殖都是等分横裂的，一个母细胞产生两个子细胞。在其分裂的过程中并没有芽孢的产生；而巨，当产生芽孢时，一个细菌只产生一个芽孢，并没有数量的增加。一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全是如此。有人在培养枯草芽孢杆菌时，曾作过追踪观察。结果发现，在接种培养4小时后即有芽孢生成。以后每隔4小时观察一次，芽孢数均呈比例增长。至24小时，约半数产生芽孢；48小时，全部变成芽孢。这种情况表明，在此情形下营养细胞转向芽孢形成有一定的概率。芽孢开始形成不必等到生长后期，更不必等到生长完全停止。因此，芽孢形成既不是细菌生活周期的必经阶段，也不是细菌繁殖的一种形式，又不是一种消极的对环境的反应，而是一个新器官的积极生成。决定芽孢形成的根本原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制芽孢形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。有时人们把芽孢与荚膜、鞭毛等并列，统称为细菌的特殊结构，这一称呼也值得商榷。因为在正常生长中的营养细胞本身并没有芽孢，而当芽孢形成后，养细胞就不复存在。虽然在有些菌类，芽孢形成后还有部分菌体残存，但这时的菌体已丧失了营养细胞的作用，不能再象无芽孢时的菌体那样进行生命活动。而荚膜和鞭毛就不同了，它们不影响细菌的生命活动，伴随着营养细胞的生存而存在。因此，把芽孢看成是一种独立的休眠体，是一种积极产生的新的生命形式或新器官，或许是恰当的。8、芽孢的成分，芽孢是微生物的休眠状态，大部分代谢活动停止。营养体是芽孢杆菌的繁殖状态。营养体约30分钟分裂增殖一次，营养、温度、pH等条件的改变会使芽胞和营养体转化。芽胞在适宜条件下一般4-6小时萌发成为营养体。营养体能产酶，目前作为饲料用酶中的很多中酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶等都可由芽胞杆菌产生。绝大多数的芽孢杆菌是一个菌体仅形成一个芽孢，芽孢位于菌体内，由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。还有大量的吡啶二羧酸钙布满整个芽孢。皮层处于核心和芽孢壳之间，含有丰富的肽聚糖。芽孢壳主要由蛋白质组成；此外，还有少量的碳水化合物和类脂类，可能还有大量的磷。最外层是外壁，其主要成分是蛋白质、一定量的葡萄糖和类脂。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强、对染料不易着色，芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力，这可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。9、芽孢的作用，分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。蛋白质晶体的毒性是有高度专性的，对其他动物与植物完全没有毒性。因此，它们便成为一种理想的生物杀虫剂，这种杀虫剂的生产，并不需将蛋白质分离出来，只需培养大量细菌，在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥，做成粉剂即可。10、芽孢的利用，芽孢可度过不良环境，对干旱和高、低温都有极强的抵抗力。条件转好时，1个芽孢可形成1个细菌细胞。有些细菌的芽孢，在干燥条件下，可保持10多年或更长的时间仍能萌发，有的能忍耐-253的低温，有的在沸水中煮30小时后仍有生活力，但也有的芽孢在8090下几分钟即死亡。因此，外科手术或注射器的消毒，一定要用高压灭菌。能形成芽孢的细菌为杆菌科中的梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的所有种类。此外，还有少数螺旋菌、孤菌和八叠球菌等属的种类。研究芽孢的形成和萌发，具有重要的理论和实践意义。因为有些能形成芽孢的细菌是人体的病原菌。在食品、医药，以及发酵工业都要彻底消灭细菌的芽孢。有些芽孢菌可用来杀灭害虫，如苏云金杆菌、青虫菌、杀螟杆菌等在形成芽孢时，还产生蛋白质伴胞晶体，对鳞翅目昆虫有强大的毒杀作用。因而将这些芽孢杆菌制成杀虫剂，实行以菌治虫，并称之为细菌农药。11、芽孢的危害，芽孢对人类也有有害的一面。最常见的情况之一，就是用加热法保存食品时，芽孢往往会造成保存的失败。这是因为芽孢极耐热，一般加热法不能把它杀死，它萌发成营养细胞后大量繁殖，会导致食品腐败变质。因此需要用高温灭菌法（121，30min）把芽孢杀死，才能使食品长期保存。医疗器械也需经高温灭菌后才能保证安全。近几年发展起来的辐射灭菌法，其主要杀灭对象也是芽孢。12、伴孢晶体，伴孢晶体（parasporalcrystal）少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体内毒素，称为伴孢晶体。特点：不溶于水，对蛋白酶类不敏感；容易溶于碱性溶剂。伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农药细菌杀虫剂。 Bacillus subtilis 图2 Bs-8093菌株的菌体形态Fig 2 Electron micrograph of strain Bs-8093四、芽孢杆菌伴胞晶体形态在芽孢杆菌中，有一类能产生伴胞晶体的，如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一类包括许多亚种并对多种昆虫具有高毒力的产晶体芽孢杆菌1。自20世纪初被发现以来，世界各国又相继从昆虫体内或土壤中分离出该种细菌，全世界收集保藏的Bt已达4万株，在害虫的防治中发挥了巨大的作用，是近年来发展最快、应用最广的微生物杀虫剂2。我国地域辽阔、生态环境复杂多样，微生物资源极其丰富，Bt LSZ9408（B. thuringiensis kurstakii）是福建省农科院生物技术研究所分离的、对多种鳞翅目具有高毒力的Bt菌株，有较大的应用潜力3,4。Bt大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，不同亚种甚至同一亚种不同菌株杀虫晶体蛋白的多肽成分都不同，杀虫蛋白晶体由多种蛋白多肽组成，这些蛋白多肽在不同类型杀虫蛋白中以不同方式结合而构建蛋白晶体5。CryI、CryIVA和CryIVB蛋白的C端区域结构相似，富含半胱氨酸蛋白多肽之间通过二硫键能自我积聚，形成稳定晶体结构，这类伴胞晶体需要一个更严格的理化条件才能形成一个可溶和具有活性的杀虫蛋白结晶。CryIIIA蛋白由于其C端区域并不富含半胱氨酸，组成蛋白晶体的蛋白多肽之间并不是由二硫键相连而是盐桥作用构成伴胞晶体。71kDa的CryIIA蛋白、72kDa的CryIVD蛋白和27kDa的CytA蛋白晶体形成和稳定需要其它多种辅助蛋白(P19，P20，orf1，orf2) 存在，表现出苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白晶体形成的多样性。由于杀虫晶体蛋白这些组成上的差异，其溶解性也是多种多样6。利用透射电镜观察了Bt标准菌株HD-1（B. thuringiensis kurstakii）的伴孢晶体形成过程。正在分裂的细胞，芽孢正在形成分裂时形成的隔膜二联体三联体正在分裂的细胞，形成隔膜，而后形成前芽孢。对称分裂和不对称分裂二联体和三联体培养24h的Bt菌株HD-1的透射电镜观察见图1。电镜观察表明：HD-1菌体为短杆状，细胞分裂时形成隔膜，隔膜的形成启动了芽孢和晶体的形成，隔膜中间向母细胞一端凸出形成脊，后隔膜两侧向端部移动，两边速度不一样，形成亚极型前芽孢，最后连接，前芽孢形成。芽孢形成于远离隔膜的一端，晶体形成在在隔膜的一端。芽孢和晶体在成熟后从细胞中脱离，晶体为菱形，芽孢椭圆形，外带有芽孢衣。细胞体内正在形成的晶体和芽孢在细胞体内形成的完整的晶体在细胞体内形成游离的芽孢细胞体内正在形成的晶体和芽孢细胞体内形成的成熟的晶体和芽孢正在脱落的芽孢正在脱落芽孢的细胞正在脱落的芽孢脱落的芽孢分裂后形成的子细胞正在分裂的细胞脱落的晶体芽孢衣已脱落的芽孢和晶体芽孢一，芽孢外有一层纤维状的芽胞衣苏云金芽孢杆菌产生的杀虫晶体蛋白可分为三种类型：130-145、65-78和27kDa。不同的亚种或菌株，其伴孢晶体可由单一的蛋白质毒素组成，也可能由两个或多个不同大小级别的蛋白质毒素组成。对鳞翅目害虫有毒性的蛋白主要是前两种类型的蛋白11。本研究的电镜观察表明Bt菌株HD-1在分裂过程中形成芽孢和晶体，晶体为大菱形。前期的预备试验还发现Bt LSZ9408晶体形态多种，除有菱形晶体外，还带有不同大小的小方形的晶体。芽孢二菱形的晶体菱形的晶体一端带缺口的菱形晶体图1 培养24h的Bt菌株HD-1的透射电镜观察二、芽孢杆菌菌落形态芽孢杆菌菌落特征是种的一个重要指标，描述芽孢杆菌菌落特征的描述一下几个方面进行，特定培养条件下的菌落大小、单菌落形状、表面颜色、表面特性、表面光滑度、边缘整齐度等等。如枯草芽孢杆菌在锰营养琼脂平板上37培养36h形成的菌落为圆形，直径3.0mm10.0mm，淡黄色，中间色深，表面平整不光滑，无光泽，边缘不整齐。4399Bacillus atrophaeus白色，背面淡黄色，圆形或不规则，不透明，表面有一层膜，无光泽4403Bacillus atrophaeus暗白色，背面橙色，表面有一层膜状物，有褶皱，干燥，无光泽4404Bacillus atrophaeus白色，背面淡黄色，表面有一层膜状物，有褶皱，干燥，无光泽，边缘不整齐4580Bacillus atrophaeus白色，圆形，表层有膜状物，有光泽，具有流动性，边缘透明4542Bacillus cereus白色，近圆形，扁平，湿润，有光泽，边缘不整齐，4679Bacillus cereus白色或培养基颜色，根状，扁平，紧贴培养基不易挑取4415Bacillus licheniformis圆形，突起，有光泽，中间有小凸起，4394Bacillus megaterium菌落大，乳白色，圆形，隆突，光滑，有光泽，周变透明，具流动性，4395Bacillus megaterium菌落大，乳白色，圆形，突起，菌落紧缩在一起，有褶皱，有光泽，4401Bacillus megaterium橙色，圆形，突起，湿润，有光泽，周边透明，4503Bacillus megaterium菌落大，乳白色，突起，有光泽，周边透明，具有流动性4749Bacillus mycoides菌落黄白色，无规则，随着划线生长，似旋风状，布满培养皿，湿润4537Bacillus polymyxa菌落米粒大小，黄白色，突起，紧贴培养基，无光泽，边缘整齐4567Bacillus polymyxa菌落小，连成一片，培养基颜色，无光泽，边缘整齐4575Bacillus polymyxa菌落小，白色，突起，无光泽，边缘整齐4400Bacillus pumilus菌落圆形，黄色，湿润，边缘不整齐，突起，4563Bacillus pumilus菌落小，黄色，圆形，隆突，有光泽4393Bacillus simplex培养基颜色，圆形，突起，有光泽，半透明，中间有凹窝4751Bacillus sphaericus菌落小，浅黄绿色，圆形，有时成片状，光滑， 有光泽4410Bacillus subtilis菌落黄白色，圆形，突起，光滑，有光泽，似透明，边缘透明圈4428Bacillus subtilis白色，枯草状，扁平，表面粗糙有一层膜状物，有褶皱，无光泽，不透明，中间凹陷4475Bacillus subtilis白色，圆形或不规则，枯草状，扁平，表面有一层膜，有褶皱，无光泽，不透明，中间有一“小亮球”4508Bacillus subtilis浊白色，扁平，边缘不整齐，中间有”小窝“4418Bacillus thuringiensis白色，扁平，湿润，有光泽，边缘不整齐4734Bacillus thuringiensis白色，根状，扁平，易挑取解淀粉芽胞杆菌图1 Bs-8093菌株的菌落形态Fig 1 Colony morphology of strain Bs-8093Bacillus azotoformans-1Bacillus badius-1Bacillus circulansBacillus clausii.tifBacillus firmusBacillus insolitus-1Bacillus lentusBacillus mojavensisBacillus smithiiBrevibacillus centrosporusBrevibacillus laterosporusJeotgalibacillus marinus.tifPaenibacillus thiaminolyticus地衣芽胞杆菌-Bacillus licheniformis解淀粉芽胞杆菌-Bacillus amyloliquefaciens.tif第二节 芽孢杆菌生长特性一、概述芽孢杆菌群体的生长繁殖可分为四期：迟缓期（lag phase），也称适应期，芽孢杆菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为芽孢杆菌繁殖极少。迟缓期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14小时。此期中芽孢杆菌体积增大，代谢活跃，为芽孢杆菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。 对数期(logarithmic phase)，又称指数期(exponential phage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。芽孢杆菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及芽孢杆菌代时而异）。此期芽孢杆菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究芽孢杆菌性状以此期芽孢杆菌最好。抗生素作用，对该时期的芽孢杆菌效果最佳。稳定期（stationary phase），该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但芽孢杆菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累ph下降等不利因素的影响，芽孢杆菌繁殖速度渐趋下降，相对芽孢杆菌死亡数开始逐渐增加，此期芽孢杆菌增殖数与死亡数渐趋平衡。芽孢杆菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽胞等。衰亡期（decline phase），随着稳定期发展，芽孢杆菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期芽孢杆菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形，生理代谢活动趋于停滞，故陈旧培养物上难以鉴别芽孢杆菌。种族增长曲线细菌培养是一种间歇的培养方式，在培养中细胞数的变化一般经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期、衰亡期等阶段，在指数生长期中，有：dN/dt= k·N(1)。在初值N(0)=N0下，上式求解得：Nt=N0·ekt.(2)，两边取对数InNt=InN0+k·t .(3)。目前的文献中，主要是采用指数模型对细胞的生长发热功率曲线进行处理，容易看出，当t时，有Nt，这就是说模型(1)只能对短时间的情况适用，对于有些实验，由于菌种培养方式、培养条件等不同，细菌的生长有不同的特征，因而，不完全符合指数生长特征，需要对指数模型进行修正，以便更好地反映细菌的生长特征，对指数模型进行修正，修正后的模型对于实验中的“s”型生长曲线很适宜。在细菌培养中，随着细菌的大量繁殖，培养基中营养物的消耗，加之有害代谢物的积累，细菌的生长速率会逐步下降，细菌的增长总要受到各种条件的约束，不可能无限增长，而有一个最大的限度Nm,为了使模型更符合实际，把指数模型(1)修改为：dNdt=k·Nt(Nm-Nt)Nm (4)。(4)式在t0时，NtN0，下的解为：Nt=Nm1-(Nt/N0-1)exp(-kt) (5)。N0、Nt分别为0和t时刻的细胞数目，Nm为生长期中最大细胞数目，k为增长速率常数。对于任何N0>0，均有t时，NtNm，也就是说平衡点N=Nm是全局渐近稳定的，(5)式变换形式碍：Nm/Nt-1=(Nm/N0-1)exp(-kt) .(6)。对于指数模型(1)，细菌的比生长速率ut=(1/Nt)(dNt/dt)=k,而修正模型(4)中，细菌的比生长速率ut=(1/Nt)(dNt/dt)=k(Nm-Nt)/Nm=(1-Nt/Nm),修正模型(4)直接反映了细菌个体繁殖对整体繁殖的影响；(1-Nt/Nm)项，反映了有限环境中剩余的尚未被细菌所占有的，可供利用的营养物或生存空间的一种量度，是细菌再增殖的潜力所在，修正模型(4)反映细菌在有限条件下其增长受到线性限制作用当细菌数Nt小时，它离限度Nm远，环境中剩余的有效营养和空间(1-Nt/Nm)多，这时细菌发展的潜力大，细菌的比增长速率ut=(1/Nt)(dNt/dt)大，而当细菌数Nt大，愈来愈接近最大限度Nm时，环境中剩余的有效营养和空间(1-Nt/Nm)愈来愈少，这时能提供细菌再发展的有效营养和空间愈来愈少，因而细菌再发展的潜力愈来愈小，细菌比生长速率um=(1/Nt)(dNt/dt)愈来愈低最后当细菌数Nt达到最大限度Nm时，有效营养和空间已尽(1一Nt/Nm)=0，环境中已不剩余有效营养和空间，这时细菌也不可能再发展了，细菌的比生长速率um下降为0。细菌的生长动力学曲线代表着细菌生长和代谢的特征，反映了其生长和代谢过程中，生理和生化特征随时间的变化情况 对于“S”型的生长发热功率曲线，按模型(4)比按指数模型处理所得的结果相关性好得多也就是说，模型(4)比指数模型更接近于这种条件下细菌生长代谢的特征模型(4)对于我们进一步地探讨细菌生长的生理特征和动力学特征具有一定的意义。我们可以看出，指数模型即为模型(4)关于Nt=0的线性化模型，因而可以说指数模型所，以用于描述细胞增长导致失真的主要原因是“线性化”所致，虽然模型(4)比指数模型更接近实际情况，但我们可以看出，模型(4)仅比指数模型右边多了一个线性因子(Nm-Nt)Nm。有的情况下，这种修正的模型仍然不足以描述实际情况，而需要加更高次的修正因子，而且对于不同特征的细菌其生长发热功率曲线不同因此，需要建立不同的热动力学模型进行处理。虽然物种具有巨大的增长潜力，但在自然界中，种群却不能无限制地增长。因为随着种群数量的增长，环境的制约因素的作用也在增大，环境中制约种群增长的因素称为环境阻力。它包括同种个体之间对食物和空间的竞争加剧、疾病蔓延、捕食者因捕食对象的增多而增多等，从而导致残废率增长、出生率降低，最终趋向平衡。因此，在自然环境中，种群的增长曲线是一个“S”型曲线（也称为逻辑斯蒂曲线）。种群达到环境所能负担的最大值，称为环境的满载量或负载能力，用“K”表示（如图1）。那么，种群为什么不能无限增长而保持在相对稳定的水平？根据对很多生物种群在有限食物和有限空间条件下数量动态的研究，种群在开始时增长比较缓慢，以后逐渐加快，当种群数量达到环境所允许的最大数量的一半时，增长速度最快，但是种群所需要的资源 种族增长曲线（食物、空间等）是有限的，随着资源的枯竭，环境阻力将随着种群的增长而成正比例增加，种群增长速度逐渐缓慢下来，直到停止增长，此外，种群内部的相互关系和其他一些环境因素，如气候、食物、空间、营巢地、天敌、疾病、种间竞争等环境阻力都会抑制种群数量无限增长。当种群增加到“K”值，会因为食物不足、空间有限、天敌增加等因素而使种群数量逐渐降低，降到基准线以下，又会因空间、食物的充裕而数量上升，所以，种群的数量会在一定范围内（基准线上下）波动，保持在一个相对恒定的水平上（如图2）。 K值的应用 种族增长曲线种数数量在达到K/2时（如图3中的A点），种群数量几乎呈直线上升，这一时期称指数生长期，A点是影响种群数量的关键点。该值可直接用于解释文中有关“种群数量变化的意义”中的几个实例问题。 种族增长曲线 - 实例实例：研究种群数量变化的规律，有利于对野生生物资源的合理利用和保护。释义：一般野生动植物种群的数量控制在环境容纳量的一半，即K/2值时，此时种群增长速度最快，可提供的资源数量也最多，而又不影响资源的再生，当种群数量大于K/2值，种群增长的速度将开始下降。所以在开发动植物资源时，种群数大于K/2值时就可以猎取一定数量的该生物资源，而且获得的量最大，当过程猎取导致种群数量小于K/2值时，种群增长的速度将会减慢，获取的资源数量将减少，而且还会影响资源的再生。种族增长曲线 - 知识拓展种群变化规律，对于控制世界人口增长，解决环境危机同样具有重要的指导意义。人类目前面临的生存危机，其根源就在于人口种群的急速增长与有限的环境资源之间的矛盾。世界人口长期以来呈指数增长趋势，主要是由于人类能够不断的开发新能源，并通过工业革命、农业革命等手段，适当地提高了自然界对人类的最大负荷量（K值）。但环境资源毕竟有限，假如人口数量增加到K值，将会引起生物圈的崩溃，后果不堪设想。所以科学的控制人口增长率，是解决环境问题的根本措施。二、芽孢杆菌的生长特性单细胞微生物（如细菌、酵母菌）接种到均匀的液体培养基后，当细菌以裂殖、酵母菌以芽殖方式增殖后，其子细胞都具有生活能力。根据不同培养时间时菌量的变化，可以作出一条反映微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线称为生长曲线(growth curve)。一条典型的生长曲线至少可以分为延迟期、指数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。本试验的目的是为了解JK-2的生长曲线特点来确定JK-2接种及发酵所需的时间。试验方法：材料，短短芽孢杆菌JK-2，NA培养基，250ml三角瓶, 移液枪，摇床。分光光度计，超净工作台。液体培养基：淀粉1.0%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.3%、蔗糖1.0%、酵母0.5% 氯化钙 05%。方法，种子液制备，取短短芽孢杆菌JK-2以无菌操作挑取1环菌苔，接入培养液中， 在30下170r/min培养48 h作种子培养液。接种培养，取盛有50mL液体培养基的250mL三角瓶4个，分别编号为CK（空白培养液）、。用1mL无菌吸管分别准确吸取0.5mL种子液加入已编号的、三个三角瓶中，于30下170r/min振荡培养。然后分别在培养2h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36 h分别测定其在600nm处的 OD值，其中的CK(空白培养液)为对照。数据处理，以时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制短短芽孢杆菌JK-2的生长曲线。试验结果表明：短短芽孢杆菌JK-2的延迟期在1-6h、指数期在6-16h、稳定期16-26h和衰亡期26h以后。这说明我们接种到发酵液的最好时间应在其生长的指数期即在24h左右，发酵的时间在26h左右为最佳，因为等到了衰亡期，细菌死亡，菌体破裂，给胞外物质分析带来困难。但是到了稳定期，在24h时，其培养液的OD值不知为何又稍有升高。时间OD值OD值OD值平均值20.0580 0.0500 0.0400 0.0493 40.1050 0.0630 0.0760 0.0813 60.1390 0.1280 0.1470 0.1380 80.4810 0.4210 0.4480 0.4500 101.3040 1.2680 1.3090 1.2937 121.8130 1.8840 1.9930 1.8967 142.2830 2.3890 2.5430 2.4050 162.4960 2.5790 2.6440 2.5730 182.5770 2.6710 2.7060 2.6513 202.6300 2.6870 2.7000 2.6723 222.7060 2.8040 2.7790 2.7630 242.7000 2.8250 2.7990 2.7747 262.4260 2.7000 2.6780 2.6013 282.4860 2.6560 2.5740 2.5720 302.3990 2.6220 2.5240 2.5150 322.4960 2.6650 2.5590 2.5733 342.4270 2.6620 2.5540 2.5477 362.5570 2.6620 2.6110 2.6100 1.2.2 菌株生物学特性生长曲线测定：将Bs-8093菌株接种到PBMY培养基中，于30、180r.min-1下培养，接种的前36h，每4h测定一次600nm下的OD值，36h后每12h测定一次，每处理重复3次。温度对生长的影响：将Bs-8093菌株接种到PBMY培养液中，置于15、20、25、30、35、