生物农药菌种基因资源库的建设与应用.doc

计划类别：项目类型：受理编号：福建省发改委科技建设项目申 请 书项目名称：生物农药高毒力菌株筛选利用与菌种基因资源库的建立项目申请单位：福建省农业科学院生物技术研究所生物农药研究中心项目负责人：刘波博士，朱育菁博士、林营志博士通讯地址：福建省福州市五四路247号省农科院生物技术研究所邮政编码：350003联系电话：0591-87308112 传真电话：0591-87308155申请日期：2005年11月10日福 建 省 发 展 改 革 委 员 会 二五年十二月目 录第一章 项目概要1一项目名称1二项目建设单位1三项目建设内容1四项目经费预算1第二章 国内外同类研究的现状和发展趋势2第一节我国生物农药发展现状2第二节生物农药技术的主要发展状况与趋势3一、生物农药技术的主要发展状况3二、生物农药技术的重要发展方向3三、生物农药技术的趋势预测4四、我国生物农药领域存在的主要问题及原因4五、国内外市场状况与发展趋势5第三节菌种资源库的建设现状5一、微生物菌种资源的特点5二、生物农药菌质资源的主要种类6三、国内外微生物资源保藏库现状6四、特色菌种资源保藏库10第三章 项目研究的必要性11一、生物农药是发展现代健康农业的重要基础11二、生物农药菌种资源的是生物农药的研发基础11三、建立生物农药特色菌种资源库可有力促进生物农药的发展12第四章 项目的研究内容和实施方案13第一节项目研究内容概要和技术路线13第二节生物农药菌株的收集保藏系统15一、生物农药菌株的收集15二、生物农药菌株的保藏系统15第三节生物农药菌种鉴定系统17一、基于脂肪酸检测的生物农药菌株鉴定系统17二、基于rRNA序列差异的生物农药菌株鉴定系统21三、基于传统生理生化方法的菌株鉴定系统24第四节生物农药菌种资源库信息管理系统24一、概述24二、拟采用的系统构建模式25三、系统数据结构和实现方式25四、拟提供的系统服务26第五节生物农药菌种筛选评价系统27一、概述27二、作物虫害生防农药菌种资源的筛选评价体系27三、作物病害生防农药菌种资源的筛选评价体系27四、作物线虫生防农药菌种资源的筛选评价体系27五、杂草生防农药菌种资源的筛选评价体系27第六节生物农药菌种应用前期研究体系28一、概述28二、菌种的生理生化特性研究体系的建立和应用28三、菌种的最适培养条件研究的建立和应用28四、建立生防菌株的共享和产业化服务机制28第五章 现有基础条件292、枯萎病生物杀菌剂BS-200030三、生物杀线虫剂线枯宁和维线克31四、微生物杀蚜剂Aphid991132第六章 工作进度安排33一、研发期限33二、项目研发进度安排33三、项目期管理33第七章 投资估算与资金筹措35一、项目预算总投资35二、项目预算分类情况35第八章 人员配备37一、概况37二、项目组人员简介37第九章 环境影响评价、社会和经济效益预测43第十章 附录：44第一章 项目概要一 项目名称生物农药高毒力菌株筛选利用与菌种资源基因库的建设。二 项目建设单位福建省农业科学院生物技术研究所生物农药研究中心。三 项目建设内容生物农药菌种基因资源库以具备用于生物农药前景的微生物菌种资源收集、整理、安全保藏、共享和利用为主要目标，通过采集、分离、诱变等方式收集整理用于生产生物农药的微生物菌种；通过分子标记和脂肪酸等结合传统方法鉴定菌株的分类地位；并采用冷冻干燥、低温冷冻和冷藏等方法对菌株进行良好安全的保藏；建立一个规范化操作的计算机管理系统对菌种的收集、筛选、保藏、应用进行全程管理；建立系统规范的研究体系确定菌株的潜在价值，并对初筛后认为有前途的菌株进行前期培养条件研究，并从中筛选克隆具备生物农药应用前景的基因，作为高毒力生物杀虫剂和生物杀菌剂的生产工程菌株，成为华东地区最大的生物农药微生物资源收集、保存、鉴定、利用中心，为我省生物农药产业发展提供菌种资源可持续的保障。同时，通过转让、合作等形式向我省乃至国内外生产企业和研究机构提供优质菌株，促进生物农药资源的高效共享和持续利用。通过菌株及其专利基因的转让和生物农药的生产，创造经济效益、生态效益和社会效益。四 项目经费预算项目预算投资总350万元。用于菌种资源库的建设和菌株的采集、筛选和前期研究。Ø 申请省预算内资金150万元。Ø 承担单位自筹资金150万元。1 第二章 国内外同类研究的现状和发展趋势第一节 我国生物农药发展现状所谓农药，即凡是用来保护和提高农、林、牧、渔业生产，以及用于环境卫生的药剂，可分为化学农药和生物农药两大类。生物农药是指利用活的有益的菌体、病毒颗粒或微生物的代谢产物，以防治农林病、虫草害和卫生病虫害的药剂。生物农药与化学农药相比，它有以下优点：（1）与传统农药比，生物农药具有更低的哺乳毒性。（2）传统杀虫剂具有广谱活性，而生物农药仅对靶标害虫有效，不会对有机体如鸟类和昆虫以及哺乳动物造成危害影响。（3）生物农药用量少，分散快，可以避免环境污染。随着社会的进步和科技的发展，人们已意识到农业生产过程中施用化学农药和化学肥料造成的危害及其严重程度，它污染环境、致使农产品质量下降，危及食品安全、影响人体健康。食品安全、人体健康、环境保护已成为举世瞩目的大问题，控制全球化合物生物积聚的呼声越来越强烈，欧洲经济委员会正在就取缔目前使用的15种化合物进行谈判，新制定的法规（1996年的食品质量管理条例，劳动者保护标准，农药再登记规定）限制化学农药的使用。我国政府已将食品安全和农副产品的无公害化生产加工技术列入重要的议事日程，制定了一系列加强食品安全、保障人体健康、实施环境保护政策和措施。要求实施无公害农业，大力发展生物农药和生物肥料，减少化学农药和化学肥料使用量，采取切实可行的措施和办法，调整农产品结构，大力发展绿色食品和有机食品生产，向市场提供更多更好的绿色食品和有机食品，以满足人们的需求。加入WTO后，农产品国际贸易的市场壁垒（关税壁垒）已经打破，“绿色壁垒”、“技术壁垒”高筑，对农产品质量提出新的要求，区域性市场保护能力越来越低，农产品贸易的准入是以价格和质量为前提，农产品质量实际上反映了各国科学技术的实力，WTO成员国都在提高农产品检测的质量标准，在公平竞争原则下，设置国际贸易的门槛。目前许多国家已宣布，没有绿色产品或绿色环境标志商品的出口在数量上和价格上受到限制，无公害技术已成为世界农产品贸易的关键，加强无公害化农业的实施，降低农产品的农药残留量，提高农产品质量，是农产品参与国际竞争的基础。微生物农药将为我国绿色农产品保驾护航，冲破“绿色壁垒”，使之在竞争激烈的国际市场占有一席之地。绿色食品和有机食品生产的关键技术是依赖于高防效、无公害、无残留的生物农药及其生化农药的研制和应用。生物农药的研制和应用是发展无公害农业的基础，是发展绿色食品和有机食品的技术保障，已成为世界各国研究的重点。为此各国政府投入大量的人力、物力、财力开展生物农药的研制和应用工作。从农业部1999年统计资料看，我国生物农药（包括生物杀虫剂、生物杀菌剂等）产量占农药总产量不足10%，生物杀虫剂的使用量占杀虫剂总用量不足1.8%，与1992年国际环发大会决议提出的2000年达到60%的要求相距甚远。目前我国生物农药菌种研究处于国际同等水平，但生物农药产业化的工艺研究较为落后，进行生物农药工程技术开发的单位不多，生物农药研发和应用水平低。生物农药技术和生物农药产品是我国今后研究开发的重点。第二节 生物农药技术的主要发展状况与趋势一、 生物农药技术的主要发展状况20世纪40年代后，农作物病虫害的防治一直以化学农药为主，形成一个“农药万能”的思想。1962年卡尔逊发表了寂静的春天，化学农药造成的危害才引起政府与公众的广泛关注。化学农药所带来的危害：环境污染（特别是对地下水和食品的污染）、害虫抗药性、对非目标生物的影响、次要害虫爆发、目标害虫再猖獗、生产和市场费用的逐渐增加，资源消耗，逐步被人们所认识。从上世纪70年代以来，国内外普遍提倡病虫害的综合治理。生物防治与其他方法相比，具有安全、持久、效果好、成本低的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生物防治的方法基本上可归纳为三大技术体系：传统生物防治、本地天敌的自然保护与利用、微生物农药的产品化。随着生物防治的推广应用，微生物农药研究与生产逐步成为生物防治的支柱产业。由于微生物农药具有许多优点，因而引起许多国家的重视，投入大量人力和物力进行开发和研究。1992年“世界环境与发展大会”的第21条决议指出“要在全球范围内控制化学农药的销售和使用，到2000年生物农药的产量将占农药总量的60%”。我国已将发展生物农药和绿色食品列入中国21世纪议程。在微生物农药迅速发展的过程中，国际上新型生物技术公司，如：Mycogen公司、Ecogen公司等应运而生，全球性大型化学农药公司和生物技术公司，如：美国的杜邦公司和孟山都公司、德国的拜耳公司、瑞士的汽巴嘉基公司、丹麦的Novo公司、日本的住友公司等也纷纷投以巨资发展微生物农药。目前，生物农药工艺技术相对比较成熟，其竞争的焦点在于生物农药品种，而生物农药品种取决于生物农药的微生物菌种，因为生物农药菌种资源基因库的建立与高毒力菌株的筛选是生物农药发展的关键。二、 生物农药技术的重要发展方向生防农药的研究与开发正在下列几个方面迅速发展：1. 菌种资源收集、鉴定与保存目前世界上许多国家都把品种资源作为开发生物农药的基础来抓。发展中国家如印度、泰国等投人大量资金进行本国微生物菌种资源的调查与鉴定；而发达国家如日本、美国则在全球范围内搜集土样、虫样，进行菌种资源的调查和鉴定，再此基础上研发出新型产品，推销回样品来源国。2. 菌种的基因工程改造 目前主要有两种方法：一种是把Bt经过改造，使之能与另一种根际微生物融合，这样，就可使喷酒的Bt制剂在植物根部附近大量增殖，从而使植物不受虫害威胁，尽管Bt对绝大多数生物无毒无害，但它对养蚕业是一个威胁，而转基因微生物对环境的危险性评估也较为复杂；另一种方法是把Bt进行改造，使生产出来的毒蛋白晶体能进人另一无任何毒副作用的杆状菌体内，这不仅可防止Bt的毒性外泄，又可以大大延长药效。3. 克隆抗虫抗病基因用于转基因作物用于生物农药的微生物之所以能抗虫抗病，主要是由于其在代谢过程中的产物对有害生物有选择性杀伤作用。克隆代谢产物相关基因，并转入作物种，可提高作物的抗虫抗病能力。目前，转Bt毒素基因的抗虫棉已在大田中使用，效果良好。三、 生物农药技术的趋势预测可以预见，随着社会的进步和科技的发展，以及人们对生存质量要求的提高，环保意识的增强，社会要求农业生产部门提供更多更好的绿色食品和有机食品，而农产品无害化又是以发展生物农药为基础。市场需求量扩大是生物农药发展的动力，可以相信在各国政府的重视和科学家的努力下，今后生物农药技术的应用领域将进一步扩大，其技术的水平将得到进一步提高，生物农药的品种将越来越多的被开发出来。生物农药将成为一个重要的高技术产业，成为保障食品安全、人体健康、环境保护的重要技术后盾，也将成为竞争非常激烈的产业之一。激烈的市场竞争，必将推动生物农药的研发水平的提高。今后将有更多品种、药效更好、价格更低、安全性更高的生物农药涌现出来，供应市场。生防农药一方面朝着发酵法工业化大生产方向发展，另一方面努力将其有效相关基因克隆进植物体内以培育出抗病虫害的植物。在不久的将来，二者在产业市场上将形成相抗衡的局面而且在短期内，无论哪一方想取代对方都是很困难的。这或许对于经济的发展更为有利。四、 我国生物农药领域存在的主要问题及原因尽管生物农药在我国具有较悠久的历史，在国际上享有较高的声誉，但我国生物农药的研究、开发、生产和应用都还存在着许多突出的问题和困难。研究开发的基础性工作并不扎实，尽管我国有一支强大的生物农药科研机构和队伍，致力于生物农药的开发，但产品的作用机理、毒理学、残留和环境等行为的研究仍不深入、不全面，其结果是研究发现具有应用前景的目标生物很多，但能成功实行商品化的生物农药品种少，其实质是用于生产生物农药的微生物菌种少。五、 国内外市场状况与发展趋势1. 国际市场1992年“世界环境与发展大会”的第21条决议指出“要在全球范围内控制化学农药的销售和使用，到2000年生物农药的产量将占农药总量的60%”。在微生物农药迅速发展的过程中，国际上新型生物技术公司，如：Mycogen公司、Ecogen公司等应运而生，全球性大型化学农药公司和生物技术公司，如：美国的杜邦公司和孟山都公司、德国的拜耳公司、瑞士的汽巴嘉基公司、丹麦的Novo公司、日本的住友公司等也纷纷投以巨资发展微生物农药。据美国环保局统计，上世纪80年代初，苏云金芽孢杆菌杀虫剂的销售额仅50006000万美元，预计本世纪初可达80亿美元。随着经济的不断增长，人们对生存质量要求的提高和环保意识的增强，社会要求农业部门生产出更多更好的绿色食品和有机食品，而农产品无害化生产是以发展生物农药为基础的，可以预见，生物农药的需求量将呈现大幅度增长趋势。2. 国内市场我国已将发展生物农药和绿色食品列入中国21世纪议程。我国是农业大国，农药需求量大，目前我国农药的使用总量达150万吨制剂，其中生物农药仅占1.8%。从省内市场看，生物农药仅从现在的1.5%上升到10%（国外为60%），全省生物农药需求将达3400吨/年（全省农药使用总量40000吨/年），销售额约1.7亿元/年。全国生物农药的需求量按同一比例将达102000吨/年，年销售额50亿/年左右，为满足人们提高生活质量的要求和应对国际贸易的需要，今后我国将大力发展无公害农产品，向国内外市场提供量足质优的绿色食品和有机食品，因此必须进一步调整农药使用结构，减少化学农药的使用，增加使用生物农药，生物农药市场前景十分广阔，成为我国今后发展的重点。第三节 菌种资源库的建设现状一、 微生物菌种资源的特点联合国环境发展大会“生物多样性公约”对生物资源的定义为：对人类具有实际或潜在用途或价值的遗传资源、生物体或其部分、生物群体或生态系统中任何其它生物组成部分。微生物资源可以包括其菌种、遗传和代谢产物及其生态组成，与动物、植物资源相比，又具有多样性、易变性、生长快等特征。生命科学研究、预防医学的研究、生物技术及其产业的研发、食品科学的研发等都是建立在微生物资源基础之上，生物农药的研究也不例外。鉴于微生物菌种资源的重要性，国内外相继建立了众多的微生物资源保藏库。动、植物资源相比，微生物资源具有更多的未知数。未知的种类资源最多，估计自然界95%以上的微生物还未被认识，现在进一步证实，尤其是不可培养微生物的大量发现，目前已知的微生物物种只是实际存在的“九牛一毛”，而我国已知的微生物仅占国际上已知总数51O ；未知的遗传资源最多，微生物的基因组和遗传产物丰富多彩，而且差别大，利用少；未知的生态系统资源最多，微生物的共生、互生、寄生、腐生、拮抗、能在各种极端环境中生长和繁殖，其机理知道少，作为生态资源开发利用则更少；微生物作为一种资源，还未没有被公众所认识。随着人口迅速增长，大规模城市化建设，城市污染日益加重生志环境严重破坏， 自然资源严重丢失。其中微生物菌种质资源的丢失可能更为严重。据统计，全球约有菌物150万种，全球已知约7万种，我国已知菌物约1万种。二、 生物农药菌质资源的主要种类可用作生防农药的微生物种类非常丰富，进行深人研究的主要有如下几大类：1. 芽孢杆菌类全世界芽孢杆菌已经发现了179种类，在我国发现的种类有45种。在芽孢杆菌中，苏云金芽孢杆菌应用的最为广泛。目前，苏云金芽孢杆菌已发现30多个亚种，大部分已能投人工业化生产 主要用于防治农林害虫 近年来，对其在治蚊方面的研究也引起了重视。BS球形芽孢杆菌类也已发现十几个亚种，主要用于防治蚊蝇等卫生害虫，部分已小规模投产。2. 病毒类NPV(核型多角体病毒)类专一性性较强 目前已发现几百种，在国外投人应用的有l0种左右，在我国实现工业化生产的只有棉铃虫NPV病毒杀虫剂，这个项目的开发已列入我国的“火炬计划。CPV(质型多角体病素)类全世界共发现几十种，在美国、日本已经开发。包涵体病毒目前已发现几十种，部分已在美国注册。3. 真菌类真菌种目前研究最多的是白僵菌和绿僵菌。目前在林业虫害防治中起着重要作用，已成为重要中国南方林区的重要常规手段之一。三、 国内外微生物资源保藏库现状1. 国外的微生物资源保藏库国外发达国家微生物菌毒种资源库建立的很早，有的已达近100年历史。发达国家的菌种保藏中心具有相对的独立性和相当强的研究力量及研发部门，除了稳定的资金支持外，还有一支基础较好的研究队伍，共享和管理机制健全(孙建宏, 童光志 et al. 2005)。储藏的微生物资源较丰富，而且信息量大，不但可提供微生物资源，很多还可提供技术服务。国际菌种保藏联合会(WFCC)由62个国家的464个菌种保藏管理机构组成，主要介绍如下。1) 美国典型菌种保藏中心ATCC(American Type Culture Collection)保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。2) 澳大利亚微生物保藏中心ACM (Australian Collection of Microorganisms)中心主要从事细菌的保藏、鉴定、研究及技术咨询服务。主要收藏细菌、还有一些酵母、丝状真菌。菌种可出售。3) 全俄罗斯微生物保藏中心VKM (Al-Russian Colection of Microorganisms)中心是俄罗斯最大的非医学微生物的保藏中心。主要从事细菌和真菌的分类和生态研究。保藏典型和参考菌株20000株，可提供微生物保藏和菌种供应。4) 日本技术评价研究所生物资源中心NBRC(NITE Biological Resource Center)由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164 株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。保藏的菌种可出售。5) 美国农业研究菌种保藏中心NRRL (Agricultural Research Service Culture Colection)是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。6) 荷兰微生物菌种保藏中心CBS(Centraalbureauvoor Schimmelcuhures)是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。菌种可出售。7) 韩国典型菌种保藏中心KCTC(Korean Collection for Type Cultures)是由政府科学技术部门支持的半政府性质的菌种保藏中心。主要从事应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏、发酵、分子生物学、分类学等的研究。该中心保藏有细菌5005株，真菌178株，酵母225株，质粒51株，动物细胞98株，动物杂合细胞21株，植物细胞31株。该中心保藏的菌种可出售。8) 德国微生物菌种保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen)成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，保藏有细菌9400株，真菌2400株，酵母500株，质粒300株，动物细胞500株，植物细胞500株，植物病毒600株，细菌病毒90株等。该中心保藏的菌种可出售。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。9) 英国国家菌种保藏中心UKNCC The United Kingdom National Culture Collection)是英国国家菌种的保藏中心。该中心提供菌种和细胞服务，保藏的菌种包括放线菌、藻类、动物细胞、细菌、丝状真菌、原生动物、支原体和酵母。该中心保藏的菌种可出售。10) 英国食品工业与海洋细菌茵种保藏中心NCIMB(National Collections of Industrial， Food and Marine Bacteria1)主要从事分类学、分子生物学的研究和采用冷冻干燥方法保藏菌种。该保藏中心保藏有细菌8500株，抗菌素70株。另外该中心提供如下服务：细菌、抗生素、质粒的分离；细菌(非致病细菌)的鉴定；保藏细菌、酵母、质粒等。保藏的菌种可出售。此外，目前国际确认的专利培养物保藏机构(IDA)有28个。表2-1 国际上确认的典型培养物保藏机构2. 我国微生物资源保藏库我国微生物资源库，虽然有的建立也较早，但由于资金和管理机制等问题，发展一度缓慢，目前国家积极加大资金投入，很多领域的微生物保藏库开始发展壮大，资源品种、数量和信息量开始加速提高，并开始实现共享。目前主要有以下微生物资源库(见表2)。中国微生物界最大的菌种保藏组织是中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM)，其下属中国科学院微生物研究所、中国科学院武汉病毒研究所、中国农业科学院土壤肥料研究所、轻工业部食品发酵工业科学研究所、中国医学科学院皮肤病研究所、卫生部药品生物制品检定所、中国医学科学院病毒研究所、中国医学科学院抗菌素研究所、四川抗菌素工业研究所、华北制药厂抗菌素研究所、农业部兽医药品监察所、中国林业科学院林业研究所，目前已经联合建立了我国第一个统一数据结构的国家级菌种保藏数据库中国微生物菌种目录数据库，它适合我国微生物学界、医学界的科研人员在寻找微生物菌种时使用，该库可在网上进行查询。BCRC (Bioresources Collection and Research Center)台湾生物资源保存及研究中心(食品工业发展研究所)。BCRC主要从事农业、应用微生物、细胞生物技术、基因工程、菌种保藏方法、工业微生物、食品科学、发酵、分子生物学等方面的研究。该保藏中心保存有细菌4541株，真菌3069株，酵母1564株，质粒451株，动物细胞356株，植物细胞20株，细菌病毒180株，重组DNA宿主217株。菌种保藏方法主要采用冷冻干燥保藏、冷冻保藏、液氮保藏、移接保藏、硅胶保藏等。该中心保藏的菌种可出售。表2-2 我国主要的菌种资源库列表四、 特色菌种资源保藏库我国是世界上十个生物多样性大国之一，生物物种极为丰富。面对二十一世纪经济发展的机遇和挑战，以现代生物技术为基础的生物资源开发是我国未来全球生物资源竞争的一个战略重点。具有行业特色的生物资源的共享和开发是其中极为重要的环节。2004年12月2425日，由中国农科院召开的自然科技资源平台共享建设微生物菌种资源描述标准和规范研究制定及共享试点建设和微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程项目专家评议会在北京召开。这次会议对项目组编制的18个微生物菌种描述规范和11个微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程进行了评议。各行业都在努力建立具有行业特色的微生物资源菌种库。南京农业大学农业建立了环境微生物种质资源库，筛选到高效安全降解菌株20多株，菌株性能优越，农药残留降解率高达在95-99.8%，而且菌株本身无毒、无害、无二次污染。2005年6月6日，茅台集团隆重宣布，茅台酒曲太空诱变育种研究取得阶段性成果，科技工作者已从茅台酒曲中成功分离，鉴定出过去未知的100多种1200多株菌种，并在此基础上建立了我国白酒行业首家酿造微生物资源菌种库(小江 2005)。目前,尚未见到专门用于服务生物农药研发用的生物农药微生物资源基因库的建设的报道.第三章 项目研究的必要性一、 生物农药是发展现代健康农业的重要基础1. 生物农药研发是食品安全、人体健康、环境保护的需要进入21世纪，食品安全、人体健康、环境保护成为举世瞩目的大问题，国际市场上“绿色壁垒”高筑，对农产品品质提出新的要求。我国政府已将食品安全和农副产品的无公害生产加工技术列入重要的议事日程。福建省政府高度重视“餐桌污染”问题，并提出了一系列解决办法和措施。化学农药残留对环境和人类健康构成严重威胁的问题，已到了非解决不可的地步。解决“餐桌污染”问题，实施农副产品无公害化生产，应从低毒、无残留的新型农药入手。因此，生物农药是我国今后农药发展的重点。2. 生物农药研发是发展绿色食品和有机食品的需要随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对绿色食品和有机食品的需求量越来越大。绿色食品和有机食品生产的关键技术，是依赖于高防效、无公害、无残留的生物农药及其生化农药的研制和应用。生物农药的研制和应用是发展无公害农业的基础，是发展绿色食品和有机食品的技术保障，已成为世界各国研究的重点。3. 生物农药研发是发展农产品国际贸易的需要加入WTO后，农产品国际贸易的市场壁垒已经打破，“绿色壁垒”、“技术壁垒”高筑，在国际贸易中对农产品品质提出新的要求。各国在同一市场条件下公平竞争，无公害技术成为世界农产品贸易的关键。加强无公害农业的实施，降低农产品的农药残留量，提高农产品质量，是农产品参与国际竞争的基础。二、 生物农药菌种资源的是生物农药的研发基础生物农药微生物菌种资源的搜集、保存、评估及利用是未来生物农药研发的重要基础，目前世界上许多国家都把品种资源作为开发生防农药的基础来抓。发展中国家如印度、泰国等投人大量资金来进行本国微生物菌种资源的调查与鉴定，而发达国家如日本、美国等则在全球范围内搜集土样、虫样，然后再把开发出的产品推销到样品来源国。种质保存广泛定义披描述为“人类利用生物的管理使其能绐人类最大的持又利益，同时保持它的潜力满足后代的需要和愿望因此，保存包括贮藏、持续利用、提高以及恢复并做为一种发展的方法，维持人类经济利益的生态系统应与完善的管理相结台。生物农药菌种保存的含义也就是指为满足生物农药研究及其产业化需要，保存相关菌种基因资源，包括生物农药菌种资源收集、保存、评估及利用，是一项跨学科课题的重要基础工程，涉及到分类学、遗传学、分子生物学、生物工程等不同领域，需众多专家学者共同参与，成立专门机构，长期开展工作。三、 建立生物农药特色菌种资源库可有力促进生物农药的发展从农业部1999年统计资料表明，我国生物农药（包括生物杀虫剂、生物杀菌剂等）产量占农药总产量不足10%，生物杀虫剂的使用量占杀虫剂总用量不足1.8%，与1992年国际环发大会决议提出的2000年达到60%的要求相距甚远。这和生物农药的实际使用效果尚不能满足要求是分不开的，可利用菌株的欠缺就是其中的一个重要原因。我省地处亚热带地区，气候高温多湿，微生物种类繁多，菌种资源极为丰富。为了开发利用微生物资源，促进生物农药研究，有必要在福建建立生物农药研发相关微生物的菌种库和基因库。建设生物农药菌种资源库，也是生物农药商业化的重要一环，无论是专利的认证，还是菌种资源的转让，都离不开菌种资源库的中介参与作用。更重要的是，通过生物农药菌种资源库及其筛选评价体系和菌株应用前期研究平台技术的建设，通过对生物农药源菌进行广泛的收集、鉴定、保存和利用研究，可大大促进生防菌株的资源共享，借助丰富的微生物种质资源选育出对生物农药产业有重大效益的优良菌种，提升我国生物农药研发水平，推动我国绿色农业乃至有机农业的迅速发展。第四章 第五章 项目的研究内容和实施方案第一节 项目研究内容概要和技术路线本项目拟研究建立的内容主要为：建立生物农药行业菌种资源库的收集保藏系统，再保藏的基础上建立脂肪酸、rRNA和传统生理生化方法的细菌鉴定系统；建立一整套针对作物病害、虫害、线虫为害以及杂草的生物农药候选菌株的筛选评价系统，通过建立并应用该系统，可大大加快菌株的筛选过程，尽快将有用菌株从保存转入前期研究阶段；建立一个候选菌株的产业化前期研究体系，通过该体系，对存在重大潜在应用价值的菌株的生理生化、发酵培养等特性进行基础性研究，使其能够尽快地进入开发阶段，为相关菌株的产业化做好充分的准备。为实现菌种资源库的高效管理，本项目计划开发一个专用的菌种资源管理信息系统，贯穿菌种资源收集、保存、鉴定、筛选评价和前期研究的全程电子化管理，并通过专用互联网站实现信息的共享，作为生物农药行业菌种资源转让、交换的电子平台。本项目的研究技术路线如下：菌种采集菌种保存系统菌株产业化前期研究体系系统菌种筛选评价体系生物农药菌株鉴定系统产业化应用菌种资源库信息管理系统第二节 生物农药菌株的收集保藏系统从全国各地收集微生物菌种资源，从丰富的天然资源中筛选含不同基因类型的特异高毒力菌株，创造具有自主知识产权的新农药，使制剂的品种多样化，从而为福建省生物农药技术研发提供基础性技术支持。一、 生物农药菌株的收集从全国各地收集微生物菌种资源，包括细菌、真菌、放线菌等，创造具有自主知识产权的新型农用微生物资源。拟采用的收集途径为野外采集、国内外引进交换、实验室诱变育种，基因修饰育种等方式。提供社会使用或作为选育新菌株时的出发菌株；在建立菌种库的同时，建立资源基因库和质粒库。二、 生物农药菌株的保藏系统1. 概述采集的菌株在常温培养基上通常只能保持很短的时间，而反复的移种传代也容易造成菌株的形态、菌落、毒力等发生变异。因此，菌株需采用合适的方式进行长期保存。通常菌株的保存方法有：Ø 常规保存法Ø 半固体穿刺保存法Ø 普通斜面保存法Ø 砂土管保存Ø 甘油冷冻保存Ø 冷冻干燥保存本试验室菌种资源库拟采取甘油冷冻保存和冷冻干燥保存法进行菌种的保存。其他方法作为辅助方法加以应用。2. 拟选用的生防菌株的保存方法依据保存菌株的时间和应用的需要，拟选择不同的方法进行保存。短期保存选用常规保存法、斜面穿刺等方法，长期的原种保存则采用甘油冷冻保存或者采用冷冻干燥干粉保存。对于特殊的菌株尚需选用的特殊的方法，如青枯雷尔氏菌可选用无菌水常温保存法进行保存。建立各种保存技术的标准操作规程(SOP).1) 常规保存法该法操作简单，采用普通冰箱进行保存。缺点是留存时问短，传代频繁，菌种易变异，只用于短期使用。2) 半固体穿刺保存法用穿刺接种法将培养物接种于半固体培养基内，经适宜温度一定时间培养后，加一层无菌液体石蜡，厚度约lcm。置冰箱保存。当需传代移种时。将半固体菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再取菌移种于新的培养基。将沾有少量液体石蜡的接种环浸于95洒精片刻，冉烧灼灭菌以免直接在酒精灯上烧灼时，液体石蜡四处溅散而引起污染。该方法保存时间有限。3) 普通斜面保存法对营养要求不高的一般细菌可接种于普通琼脂斜面上。斜面底部加少许无糖肉膏液，以防干涸（部分要求保持干燥的菌不加）。用橡皮塞塞紧，经培养后，存放于4冰箱中，一般可保存3-6个月。4) 砂土管保存法适用于产芽孢的细菌。将过筛后的中性细砂烘干。装入小试管内约lcm高。塞上棉塞，1602小时灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物。制成菌悬液。然后吸此菌悬液约0.5mL注入砂土管内，以砂土全部浸湿为度。塞好棉塞，放人干燥器内抽干。然后放在装有氯化钙(吸水剂)的干燥瓶内，置4冰箱保存备用。需用时可取一接种环砂土接种于适宜培养基上培养即可5) 甘油保护超低温保存法甘油超低温保存可保存几年时间，适用于菌株的长期保存。利用甘油作为保护剂，按一定比例混入培养好的液体培养基中，快速冷冻后置-80冰箱中保存备用。其操作特点及步骤如下：菌种培养：按不同细菌的营养要求制备液体培养基，接种后置适宜温度下培养适宜时间，确保生长良好无污染。菌种保存液制作：配置体积分数为0.8的甘油生理盐水，121.3，15Min灭菌。菌种保存管准备：采用带螺盖的专用菌种保存管，包装后高压蒸汽灭菌。苗种处理及保存：取培养好的培养物和甘油保存液混合，后冷冻。 6) 冷冻真空干燥保存法冷冻真空干燥保存是当前保存菌种的最佳方法，具有如下优点：Ø 使用范围广：除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此方法保藏；Ø 保藏期长，成活率高：一般微生物至少可保存l0余年；Ø 微生物在保藏期内可避免其它杂菌污染；Ø 便于携带运输，易实现商品化生产。所需的设备为冷冻真空干燥机。操作步骤为：材料：(1)无菌脱脂牛乳(保护剂)：将牛乳煮沸待冷后，静置冰箱冷却，除去上层脂肪反复3次然后用脱脂棉过滤。吸取牛乳依需用量分装用高压蒸汽l0磅灭菌15r