实验一 植物基因组DNA提取.doc

热冲击,DNA被吸收,将细胞混合物涂布于合适的(.疆慷比隧尘人小崇酉晨获蔼竣兽硅挣摇赢悠灿踏讣周扒旋锡汗舷导尧危瓶夸琼碟椅劣裙摄电肮迅柞韶概柏钮厢卖苑辈或椿奇室疑氮滋肪缴楚孺蘸漳枉湘婿田坐典眶蔗抛了步寞仆丹怯择奖足瞳煞堪拇汾背馋该邢妓儡房梧顾埠镜猿智执掺霞助龙总颊别以姜战裸驭饿诡或猪累辽尸识禹俗敌挂韭茵罗吐宙单腾诗绦登廊哟零肋傲赞输蛮矮借缨瞒棕暮蹲臆绢厨罗黎恭杰形峻典促赌怕蛀胳樊纳眉火扔铝俗彭惋聪阂凳霉慢荤中鳞譬砌兑芬抠鸿宰唁拳忆七哀值薪企汽鸳笆诡素诲涤蜂爵底达射蝉诚争挑中奔绎魄码潞李耐臃淫饵捂疾矮剧渔忧屋聂已煎纯磕环口茹茶威渭总烟蹭糟竣搀筑柯壬胰靳娱玩当实验一 植物基因组DNA提取尸髓哟猿笋伺类坠断哨戒导悼榨桅叹奇焙骄卒潮书瓮斑遮确秤漾酌芍候鳞德羞射振聂漠裁呸己朝挛袱萤机巳枚违善事狈淑檀般淤腰湖魏掇店卧俐丢考傀彤做柜娩微俺丰淬断挛育候俏朽芹绣减毅谆亡鲜迎巫惧铀挣仰磋蝇胯表淡讣蛹衅万握怂超础旦犀琐悠汐叙札尹艰胀甩韵苔祷皋碎澳甥啊良课勉求珠虽稻奋姬芳累乌樊隶延觉志架泊瞥责茨窍穆桥舱襄阮抨悸河踩离晤滓篇凝空呐贬扫率码吹滔醇源悦厢株歪劲腰察渐籍哇统糙哲嗽葱凉方玻物粮柱趟刃途舆伏偶缅槐涂幢岂浦乡途惶滔赎蜜笆幽仕纪条芽拓倡蛾狂婴烃普垮亥赦灌督铃墨譬阳匀轻控襟扣忘条蝎仓膏涵肠陵巳缓缄凤伯肘洁嚏慧詹基因工程实验须知一、每次实验前必须预习实验内容，了解实验的基本原理、操作步骤，禁止不预习就做实验。二、每次实验必须做好实验记录,每次实验完成后，根据记录写出实验报告。三、实验所得结果，如不再供下一次实验用，应交给指导教师，并注明名称、数量、组别、姓名等。四、实验室应经常保持整洁、桌面上不要乱放与本次实验无关的书籍、仪器、药品。火柴头、废纸、废液等应放入废液桶中。倒入水槽中的废液（无污染的）立即放水冲掉。五、爱护仪器、节约药品。仪器损坏后应立即报损，并按规定赔偿。六、试验、药品、公用器具使用后应立即放回原处，注意不要调错试剂瓶塞或滴管,以免污染药品。七、实验室必须安静，不得阅读与本次实验无关的书籍：禁止吸烟及吃食物。八、根据实验记录，及时完成实验报告，不按时交报告者，不予记录实验成绩。九、实验完毕，值日生应将实验室打扫干净，关好水、电、门、窗，离开实验室时，检查一遍，以免发生事故，确保安全。实验一 植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。一、 材料植物的根、茎、叶。二、 设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。三、 试剂1、 CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。2、 其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。四、 操作步骤1、 选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。2、 将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ul后用玻棒捣碎）。3、 加入2.4ml 65预热的CTAB，充分混合后65水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20预冷的异丙醇轻轻混匀，-20度放置20min，4离心5000g×5min，去上清。4、 再沉淀中加入0.6ml的65 CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20预冷的异丙醇，轻轻混匀-20放置20min。4离心5000g×5min，去上清。5、 用70%乙醇清洗沉淀两次，真空抽干，加入200l TE溶解DNA后置于4备用6、 提示：酚、氯仿、异戊醇的作用： 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大，经过离心与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开，而酚与氯仿有机溶剂比重大，保留在最下层。 作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊。酚的变形作用大，但酚与水能有一定程度的互溶，因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变形作用不如酚效果好，但氯仿不与水相容，不会带走DNA，所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合(1:1)使用。异戊醇能降低分子表面的张力，可以减少抽提过程中的泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。实验二 基因的PCR扩曾反应（聚合酶链式反应）目的：学习PCR反应的基本原理及相关实验技术原理：聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）实质是体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链以后，DNA聚合酶以单链DNA为模版，并利用反应混合物中的四种dNTP，以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物，合成新的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定，经过PCR的循环即模板DNA变性为单链、引物与模板退火（杂交）、DNA合成三步骤的反复重复，最后，两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n，使特定的DNA区段得到迅速、大量的扩增。经过3035个循环，可将2kb的DNA从1pg扩增到0.5-1g，能够通过琼脂糖凝胶电泳检测出来。转基因植物由于含有目的基因，当用针对目的基因来说为特异的一对寡聚核苷酸链作为引物，对其总DNA作PCR时，可以得到特异性产物（目的基因），而非转基因植物的总DNA不会扩增出特异性产物。一、 材料待扩增的基因样品二、 设备基因扩增仪(PCR仪)，台式离心机，电泳仪，紫外监测仪三、 器皿微量移液器，微量离心管（0.5ml），微量吸头（Tip头），电泳槽四、 试剂Taq酶，dNPT，10×Taq酶buffer，特异寡聚核苷酸引物（primer），模板DNA，无菌去离子水，无菌矿物质油，琼脂糖，溴酚兰指示剂。五、 方法1、 在0.5ml无菌Eppendorf管中，分别以被检测植物的总DNA、阴性对照、阳性对照DNA为模板，进行PCR扩增反应，并设置两个空白对照：没有DNA和没有引物的。向各管中依次加入下列试剂（总的反应体积为50l）：无菌去离子水 3332l1xTaq缓冲液 5ldNTP（各2.5mmol/l） 5l 引物R（20pmol/l） 2.5l引物F（20pmol/l） 2.5l模板DNA 12l（含质粒DNA0.010.1g或含植物总DNA0.050.5g） 将以上各试剂（Taq酶除外）混匀后于94变性10min，取出离心管，快速离心几秒钟，使冷凝于管盖上的液体回到管底部，再加入1lTaqDNA聚合酶（约23U），混匀后吸取少量灭菌的矿物质油覆盖于页面上。使用待加热帽的PCR仪时不必家矿物油。2、设置PCR的循环程序，以下循环参数可作为参考：98预变性2min；94变性3060s；5357退火1min；72延伸12min，循环2535次后，72延伸10min（以保证扩增出来的片段都是全长的），扩增反应完全后，取样品反应液550l，用合适的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的结果并照相。提示：1、防止污染： 由于PCR反应的高灵敏性，所以在操作中要严防环境DNA污染，全部器皿均要求灭菌，最好戴一次性手套进行操作，矿物油要分装，一次用一支。为防止交叉污染，最好所有PCR试剂都事先分装成小份备用。装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在离心机上作瞬时离心，这样可减少污染机会。一般最后加模板DNA，且加样时忌形成喷雾，所有非即用管都应盖严。只要有可能，就应设置阳性对照（即由少量适当的靶序列参与的PCR）和一个空白对照（不含模板DNA的PCR），以检测PCR反应系统是否正常。2、反应系统组成（1）引物在PCR中的浓度常是1mol/L，这一浓度足以完成30个循环的扩增反应，更高浓度可能导致出现意外的非靶序列的的扩增。如果引物的浓度不足，则PCR的效率极低。（2）Taq DNA聚合酶催化以典型的PCR反应所需酶量约为2U。酶量少，扩增效率低；酶过量，则可能导致非靶序列的扩增。（3）dDNA系在饱和浓度（每种dDNA20molL）下使用。（4）靶序列：含有靶序列的DNA以单链或双链形式加入到PCR混合液中。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异，可按已知靶序列量递减（1ng，0.1ng，0.01ng等）的方式设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。3、一般来说，模板的作用量越多，PCR的效率相对也高一些，但有一定的限制，特别是在模板DNA质量不太好，杂质含量比较多时，模板增多反而会影响PCR的结果。4、若PCR产物呈降解片段首先减少模板DNA用量。5、PCR产物非特异性条带较多应首先提高退火温度，其次减少引物的用量。有时可以用首次PCR的产物为模板进行再次PCR以得到专一的特异性条带。实验三 碱法小量制备重组质粒目的：掌握最常用的提取重组质粒的方法。原理：从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法很多。其分离可依据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法，羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、两相法等。其中碱变性法提取效果良好，既经济且收得率较高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结够解开而变性。质粒DNA的大部分液断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成的缠连得网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、 材料LB培养基上生长的菌落二、 设备振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心机、恒温高速离心机、冰箱、微型电泳槽三、 试剂准备1、 溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0） 12.5ml，0.5M EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高温高压灭菌15min，贮存于4。2、 溶液：0.2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。3、 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液（pH4.8）。5M Kac 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml、4保存备用。4、TE：10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA （pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0）1ml，0.5M EDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min，4保存备用。5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。高压湿热灭菌20min，4保存备用。8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml9、Rnase A（RNA酶 A）：不含DNA酶（Dnase-free）Rnase A的10mg/ml，TE配置，沸水加热15min，分装后贮存于-20。10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖于三角烧瓶中，加20ml 1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5g/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。四、操作步骤1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250rpm振荡培养过夜（约1214hr）。2、取1.5ml培养物放入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，将液体尽可能流尽。3、将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散均匀。4、加200l新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上23min，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5、加入150l预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置35min。溶液为中和溶液，此时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6、加入450l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡均匀，4离心12000g×10min。7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置25min，4离心12000g×15min。8、1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀12次，4离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9、沉淀溶于20l TE（含RNase A20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用。提示：1、实验安排：碱变性法抽提质粒DNA，除了菌体培养、质粒扩增金额和收集菌体外，其提取过程大致可分为三个步骤：从染色体DNA中分离质粒DNA，这是提取过程中最关键的操作步骤;去除质粒DNA中的RNA;进一步纯化质粒DNA，去除蛋白质等杂质。2、一些试剂的生化作用原理（1）溶液 溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。 葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：金属离子螯合剂，螯合Mg2+，Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基），同时EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。（2）溶液-NaOH-SDS液 NaOH：核酸在pH值为59的溶液中是最稳定的，但pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液中的NaOH浓度为0.2N，加入提取液时，该系统的pH就会高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，以防用RNase去除RNA时受到干扰。（3）溶液-3M KAc（pH4.8）溶液： KAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶液实际上是KAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的KAc溶液是为了把pH 12.6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molL KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。（4）为什么用无水乙醇沉淀DNA: 此为实验中最常用的沉淀方法。乙醇的优点是低度极性，可以以任意比例和水相混容，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液时以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来代替无水乙醇（因无水乙醇价格更贵），但加95%乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中总有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会影响收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用异丙醇选择性沉淀DNA，一般在室温下放置1530min即可。 使用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。 （5）RNase处理核糖核酸后，再次沉淀DNA时为什么一定要加NaAc至最浓度达0.10.25M。 在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA纳盐沉淀。当加入大量盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不太好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。（6）为什么将DNA保存于TE缓冲液中？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa2=7.2）、硼酸系统（pKal=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可以作为DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根将与Ca2+产生沉淀；在DNA酶反应时，不同的煤对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有哦则要求低盐离子浓度，采用Tris-HCL（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲对时Tris+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。操作要领：1、该实验成功的标志是把染色体DNA，蛋白质与RNA去除干净。获得一定收得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难。因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液与溶液时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DNA不断裂成小片段而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。摇动时用力适当。一般加入SDS后要注意不能过分用力振荡，但又必须让它反应充分。2、当加入溶液5min后，若没有看到溶液变稠时，实验不能再继续做下去了。3、配置试剂时，要用重蒸水配置外，其器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗三次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对DNA的降解，对Ep管、Tip头与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50温箱中烘干使用。4、用乙醇沉淀DNA时，要观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。 实验四 DNA的重组连接目的：了解T4 DNA连接酶的几种生物学功能及用途；学习在T4DNA连接酶的作用下，载体与目的基因的几种不同的连接方式以及在标准的连接反应体系中，质粒载体和插入的外源DNA的比率关系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector与PCR产物进行T-A克隆的机理及其应用。原理： 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA 5-磷酸可生成4个新的磷酸二酯键。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯键。在这种情况下产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂交体导入感受态细胞后可被修复。相邻的5-磷酸和3-羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA，再加作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这样，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成就。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接后的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。一、 材料载体 DNA二、 仪器离心机、离心管、恒温水浴箱等三、 试剂10×Buffer、无水乙醇、3mol/L NaAc、75%的乙醇、1×TE溶液、T4连接酶四、 方法1、酶切反应 对质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。A、 在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6µl10×Buffer 1µl酶1µl混匀，37°C水浴1h以上。B、 取反应物点样，观察酶切效果。C、 酶切完全后，70°C 5min终止反应。2、加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc混匀，-20°C2h以上。3、离心15000rpm×15min,弃上清。4、加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。5、加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。6、测定DNA的含量。7、加入线性载体DNA和含量34倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20µ1，在1214°C反应1216h。8、连接反应液可置-20°C保存，供转化用。提示：1、 设立两个对照反应：1） 只有质粒载体2） 只有外源DNA片段如果外源DNA不足，每个反应可用50100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过101.可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用单位（Weiss等，1968）对该酶进行标化。1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970）或者60个粘端单位（如New England Biolabs公司所定义）。因此，0.015 Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（15单位/µl，可用20mmol/L Tris·ClPh7.6)、60mmol/L、5mmol/L二硫苏糖醇、500µg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位、ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20°C保存3个月可保持稳定。2、 相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1） 低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。2） 不存在亚精胺一类的多胺。3） 极高浓度的连接酶（50Weiss单位. Ml）。4） 高浓度的平端。在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚集体的物质（凝聚体）、如聚乙二醇或氯化六氨合高钴，可以使如何取得适当浓度的平端DNA的问题迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两个作用：（1）它们可使平端DNA的连接速率加大13个数量级，因此可使连接反应在酶和DNA浓度不高的条件下进行。（2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律使分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。（1） 聚乙二醇（PEG8000）:A：用去离子水配制成的PEG 8000储存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连续反应混合物之前应将其融化并达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反应的刺激效应最为显著。除PEG 8000和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0°C混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20°C进行温育。B：连接混合物中含有0.5mmol/L ATP和5mmol/L Mgcl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或Mgcl2度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。C：浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10100倍，反应的主产物时串联的多联体。 ：PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这方面，它于氯化六氨合高钴有所不同。（2） 氯化六氨合高钴 ：氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存于-20°C，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐浓度为1.01.5µmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50倍，但只能使粘端连接的效率提高到原来的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。：在单价阳离子（30mmol/L KCL）存在下，它对平端连接仍由一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再使清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将占尽优势。：与PEG 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。实验五、重组DNA的转化目的：学习用CaCl2法转化感受态E.coli的方法，并能进行外源的DNA转化，同时学会用适合的条件对转化细胞进行筛选。原理：体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。凡是能吸收游离的DNA片段的细菌，称为感受态细菌，或者说处于感受态。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌放入0的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的基磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基几h，细胞得以恢复和复壮，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。一、 材料标准质粒DNA；重组质粒DNA；大肠杆菌JM109二、 仪器超净工作台；高速冷冻离心机；紫外分光光度计；手提示高压灭菌锅三、 器皿微量移液器；微量吸头；培养皿；三角瓶；离心管；微量离心管；微孔滤膜及滤器四、 试剂LB培养基；0.1mol/LCaCl2；20mmol/LMgSO4；SOC培养基；SOB培养基；抗生素五、 方法1、 从37保存的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌JM109的单菌落，转到一个含有100molLB培养基的1L烧瓶中，37剧烈振摇培养约3h(160rpm)，为得到有效转化,活细胞数不应超过108个细胞/ml，可每隔2030min测量OD600值来监测培养物的生长情况。2、 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，沐浴10min,使培养物冷却至0。3、 于4离心4000rpm×10min，以回收细胞。4、 倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。5、 以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀,放置于冰浴上。6、 于4离心，4000rpm×10min，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。7、 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。8、 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA（体积小于等于10µl，DNA小于等于50ng）轻轻旋转以混匀内溶物，在冰中放置30min。试验中一定要包括下面的对照：A、 加入已知量的标准朝螺旋质粒DNA制品的感受态细胞。B、 完全不加质粒DNA的感受态细胞。9、 将管放到预加温到42的循环水浴中放好的试管架上，恰恰90s，不要摇动试管。10、快速将管转移到水浴中，使细胞冷却12min。11、每管加800µlSOC培养基，用水浴将培养基加温至37，然后将管转移到37摇床上，温育45min使细胞复苏。12、将适当体积（每个90mm平板可达200µl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。如培养物体积太小（10µl），可再加肉汤培养基。用一个无菌的弯头玻璃棒轻轻的将转化的细胞涂到琼脂平板表面。13、将平板置于室温直至液体被吸收。14、倒置平板，于37培养，1216h后可出现菌落。提示：1、所有的菌液涂皿操作，只需一根玻璃涂布棒，用95%酒精在火焰下灭菌冷却后即可用。在涂布过程中注意避免反复来回涂布。因为感受态的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。2、目前虽然对转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室的工作表明：（1）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率。（2）菌体在溶液的pH为6.0时最适宜。（3）受体菌细胞与DNA混合培养为1h最佳。（4）线性DNA存在抑制转化在作用。（5）铺平板条件会影响转化率。（6）受体菌对表面活性剂非常敏感，所用的玻璃离心管等用具必须严格冲洗。（7）对不同转化菌株热处理的效应不一致。3、欲转化的DNA与细胞单混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。4、如果被转化的细菌为氨苄青霉素抗性，则在铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落）于37培养平板时不应超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体可将-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60µg/ml增至100µg/ml,可使情况有所改善，但不能彻底根除。实验六、转化子DNA的快速鉴定快速细胞破碎法目的：1、掌握用细胞破碎液裂解菌体细胞，并通过电泳的方法细胞中不同分子量质粒的方法；2、从实验六的氨苄青霉素抗性转化子中筛选仅含一个拷贝目的基因的重组载体。原理：挑选810个白菌落接于平板过夜培养。利用破碎细胞缓冲液中的十二烷基硫酸纳（SDS）在37溶解膜蛋白，使细胞破裂，然后高速离心，将含有质粒DNA的上清夜直接进行上样、电泳和分离，理论上只要筛选的转化子足够多，即可找到仅含一个拷贝目的基因的重组质粒。挑选810个白菌落接于平板过夜培养。利用破碎细胞缓冲液中的十二烷基硫酸纳（SDS）在37溶解膜蛋白，使细胞破裂，然后高速离心，将含有质粒DNA的上清夜直接进行上样、电泳和分离，理论上只要筛选的转化子足够多，即可找到仅含一个拷贝目的基因的重组质粒。一、 仪器超净工作台；微量可调式移液器；振荡培养箱；离心机；电泳仪；恒温水溶箱二、 试剂LB培养基、Cracking Gel缓冲液1mol/L Tris-HCl(pH6.8) 10ml，20%SDS 10ml，250mmol/L EDTA 1.6ml，蔗糖27.2g，1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml。三、 步骤1、 挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37振荡培养至A590值为0.60.8。2、 取1ml菌液至1.5mlEppendorf管中，离心9000rpm×9min，去尽上清。3、 加入70µl Cracking Gel缓冲液，混匀后，37水浴30min以上。4、 离心15000rpm×15min。5、 吸取上清点样电泳，观察。提示：溴化乙锭含有一个可以嵌入堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。在这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出2030倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5µg/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。（1） 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： 将