产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的优化.doc

题目：产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的优化 学 院 ：生命科学学院 专 业： 生 物 科 学姓 名：学 号：指导教师： 毕业设计（论文）时间：2009年2月25日6月19日 共17周中文摘要为筛选蛋白酶的高产菌株，利用牛奶水解圈作为筛选模型,从山东理工大学附近农田土壤中筛选得到了产蛋白酶能力较高的细菌whr1,初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌属，对其产酶条件进行优化,最终得到最适培养时间为24h，培养基中最佳碳源为质量浓度 10g/L 蔗糖 ,最佳氮源为质量浓度15g/L酵母膏,最适初始pH值为6.0,最适发酵温度为35,最适装液量为250mL摇瓶装30mL培养基。关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化ABSTRACTIn order to screen a bacterium which can produce protease, milk hydroxylation circle was used as screening model in this paper. The bacterium whr1 was achieved by screening from the soil near the Shandong University of Technology, and were preliminarily identified belong to Bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30; the appropriate load is 30mL culture medium in 250mL flask.Keyword: Screening，Identified，Protease，Culture optimization目录中文摘要IABSTRACTII目录III第一章 引言11.1 微生物蛋白酶的分类11.1.1 按照蛋白酶水解肽链的方式分类11.1.2 按照蛋白酶的作用最适温度分类21.1.3 按照蛋白酶的作用最适pH分类31.1.4 按照蛋白酶的作用机制不同分类31.2 微生物蛋白酶的分布41.2.1 细菌51.2.2 放线菌51.2.3 真菌51.2.4 病毒61.3 微生物蛋白酶的优点61.4 微生物蛋白酶的应用71.4.1 在玉米加工中的应用71.4.2 在食品工业中的应用71.4.3 在动物饲料加工中的应用71.4.4 在纺织行业中的应用81.4.5 在洗涤剂中的应用81.4.6 在皮革生产加工中的应用81.4.7 在生产富含高营养注射用水中的应用91.5 国内外蛋白酶的研究状况及其前景91.6 本实验的研究目的与内容9第二章 实验材料与方法- 11 -2.1 实验材料与仪器- 11 -2.1.1 实验仪器- 11 -2.1.2 实验材料- 11 -2.2 实验方法- 14 -2.2.1 菌株筛选- 14 -2.2.2 革兰氏染色- 15 -2.2.3 芽孢染色- 16 -2.2.4 蛋白酶产生菌酶活力的测定- 16 -2.2.5 产酶条件优化- 18 -第三章 实验结果及讨论- 20 -3.1 实验结果- 20 -3.1.1 目的菌株的分离纯化- 20 -3.1.2 菌株的形态特征- 21 -3.1.3 蛋白酶酶活测定- 21 -3.1.4 不同培养时间对产酶的影响- 23 -3.1.5 不同碳源对产酶的影响- 25 -3.1.6 不同氮源对产酶的影响- 28 -3.1.7 培养基不同初始PH值对产酶的影响- 30 -3.1.8 不同温度对产酶的影响- 33 -3.1.9 不同装液量对产酶的影响- 35 -结论- 38 -参考文献- 39 -致谢- 41 -译文- 42 -第一章 引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的601。蛋白酶的研究有着悠久的历史。远在三千年前，人们对酶的本质还没有了解时，我们的祖先就已把它用于制酱技术中；1908年德国人Rohm就开始利用酶制剂鞣制皮革；随着生物化学和分子生物学的迅速发展，蛋白酶的研究和应用更加广泛深入。目前已被结晶和纯化的蛋白酶有100种之多，它的应用已经深入到食品、酿造、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂以及水产加工等行业，对国民经济的发展中起着重要的作用2。 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产，在所有蛋白酶资源中微生物蛋白酶资源占有重要位置，在已知的3000多种蛋白酶中，绝大多数来源于常温生物3，其作用的温度、pH、离子强度范围均较窄，不能满足日新月异的工业技术发展和应用的需要4。因此，进一步寻找和开发新型的微生物蛋白酶资源，依然具有重要的科研和应用意义。 1.1 微生物蛋白酶的分类 根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会规定，蛋白酶属于第3类水解酶类的第4亚类。但由于蛋白酶作用方式和结构的多样性，往往不能与通用命名系统的命名一致。目前对蛋白酶的分类主要有以下几个标准： 1.1.1 按照蛋白酶水解肽链的方式分类 按水解肽链的方式不同，微牛物蛋白酶可分为内肽酶和外肽酶。 (1) 内肽酶：从内部切割多肽链从而产生大的水解片段的酶被称作蛋白水解酶或者内肽酶。许多丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶都属于此类。(2) 外肽酶：从一端切割多肽链从而释放出一个或数个氨基酸残基的酶称为外肽酶。作用于氨基末端的为氨基肽酶，如Ito K等从牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中分离的脯氨酰三肽基肽酶，Hatanaka T等从链霉菌sp.TH-4中分离出的氨基肽酶N(TH-4AP)等；作用于羧基末端为羧基肽酶，如硫叶菌产生的耐热金属蛋白酶CPSso5等，对蛋白质分子而言，外肽酶的作用是有限的，内肽酶显然更宜于水解消化蛋白质6。 1.1.2 按照蛋白酶的作用最适温度分类按作用最适温度不同，微生物蛋白酶可分为低温蛋白酶、中温蛋白酶、高温蛋白酶。(1) 低温蛋白酶：最适作用温度为510，到30极易失活。通常被称为低温酶(psychrophilicenzymes)或适冷酶(coldadaptedenzymes)，是一大类在030内催化效率比相应的中温酶高，对热相对不稳定的蛋白酶9。目前发现产低温蛋白酶的主要细菌都属于Pseudomonas属，其次还有Xanthomonas属,Aeromonas属以及适冷性酵母菌等。(2) 中温蛋白酶：最适作用温度1040，高于50极易失活。李爱芬等从海产品虾蟹中分离出的菌株YM007，其产生的中温中性蛋白酶最适作用温度为45。 (3) 高温蛋白酶：最适作用温度6080。主要来源于嗜热微生物。高温蛋白酶由于具有显著的热稳定性及其对有机溶剂、去垢剂和变性剂较强的抗性而在蛋白酶应用的各个领域显示出极大的潜力10。国内外所报道的高温蛋白酶主要来自嗜热脂肪芽孢杆菌。潘惠霞等从新疆荒漠地区分离到一株嗜热芽孢杆菌，其产生的高温蛋白酶最适反应温度65，55处理一小时活性无任何损失；更有一些高温蛋白酶最适温度高于85ValasakiK等曾从瑞士乳酸杆菌中分离出的两种壤适pH7.0，最适温度60的高温蛋白酶。1.1.3 按照蛋白酶的作用最适pH分类按作用最适pH不同，微生物蛋白酶可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性酸性蛋白酶。 (1) 酸性蛋白酶：作用最适pH2.0-5.0。除胃蛋白酶外，多产生于真菌，如黑曲霉酸性蛋白酶。一般分子量为35000Da，酶分子中酸性氨基酸含量低，在pH2.0-6.O最稳定；含有两个羧基，能为重氮乙酰正亮氨酸甲酯(DAN)失活，不受螯合剂、巯基试剂或丝氨酸蛋白抑制剂的影响。 (2) 中性蛋白酶：作用最适pH 7.0左右。一般分子量在35000-45000Da之间，pH6.0-9.0时最稳定。活性中心为金属离子，常是Zn+，可受到金属螯合剂EDTA和邻二杂氮菲的可逆抑制，但不被二异丙基氟磷酸和巯基试剂所抑制。Cho SJ等从一种韩国的豆制品中分离出的解淀粉芽孢杆菌FSE-68能产生一种中性金属蛋白酶NPR68，Pillai P11等从Vajreshwari温泉中分离出的枯草杆菌P13产生一最适温度为65的中性丝氨酸蛋白酶。链霉菌属产生的中性蛋白酶也多有报道78。 (3) 碱性蛋白酶：作用最适pH为9.5-10.5，在pH5.0-10.0时较稳定，分子量为2600034000kDa，酶分子中缺少半胱氨酸形成的二硫键，其活性中心为丝氨酸，能被二异丙基氟磷酸及苯甲基黄酰氯所抑制，但不被巯基试剂和金属螫合剂所抑制，枯草杆菌碱性蛋白酶，短小芽孢杆菌碱性蛋白酶等都具有此类性质。 1.1.4 按照蛋白酶的作用机制不同分类 按作用机制不同，微生物蛋白酶可分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶和金属蛋白酶。 (1) 丝氨酸蛋白酶：活性中心含有丝氨酸的一类蛋白酶。最适作用pH 7.0-11.0,等电点在pH 40-60之间，分子量1800035000Da。据其结构的相似性,丝氨酸蛋白酶被分为二十个家族，六个大类11：糜蛋白酶(SA)、枯草杆菌蛋白酶(SB)、羧肽酶(SC).EscherichiaD-Ala-D-Ala肽酶A(SE)、LexA抑制物(SF)，其中SA、SB、SC都有Ser-His-Asp三个氨基酸组成的活性中心，和活性中心附近保守的甘氨酸残基形成Gly-Xaa-SeR-Yaa-Gly模体。(2) 天冬氨酸蛋白酶：活性中心含有天冬氨酸的一类酸性蛋白酶。胃蛋白酶和凝乳酶都属于此类。大多数天冬氨酸蛋白酶最适pH为3.04.0，等电点在pH 3.04.5之间，分子量3000045000Da。活性中心的天冬氨酸残基位于Asp-Xaa-Gly模体内，其中Xaa可为Ser或Thr。此类蛋白酶可被胃酶抑素抑制，对重氮酮类化合物等比较敏感。 (3) 巯基蛋白酶：活性中心含有巯基(-SH)的一类蛋白酶，如木瓜蛋白酶、溶酶体蛋白酶等。已发现的有二十个家族，其活性依赖于由Cys-His或His-Cys组成的活性基团。通常巯基蛋白酶只在还原剂如HCN或半胱氨酸存在下才有活性。最适pH近中性，对巯基抑制剂如PCMB敏感，对DFP和金属螯合剂不敏感。 (4) 金属蛋白酶：活性中心含有二价金属离子的一类蛋白酶。高等生物的胶原蛋白酶、蛇毒液中的出血毒素及细菌的嗜热蛋白酶等均属此类。已发现的金属蛋白酶有三十多种。据其作用的特异性，可分为中性金属蛋白酶、碱性金属蛋白酶、Myxobacter1和MyxobacterII四类。其中由Pseudomonas Aeruginosa和Serratia spp产生的碱性金属蛋白酶适宜作用pH为6.09.0，分子量在4800060000Da之间。而金属基质蛋白酶因能在组织的形成和分化中降解细胞外基质，对某些疾病如癌症、关节炎的治疗具有非常重要的意义。Wang SL等分离的蛋白酶产生菌株TKU014能产生三种能分解角蛋白的碱性金属蛋白酶。 1.2 微生物蛋白酶的分布 微生物蛋白酶的分布非常广泛，细菌、放线菌、真菌、病毒等中都有能够分泌蛋白酶的。 1.2.1 细菌大多数的商业蛋白酶(主要是中性和碱性蛋白酶)都来源于细菌。产生胞外蛋白酶的细菌有枯草杆菌、芽孢杆菌、马铃薯杆菌、节杆菌、假单胞菌、弧菌、大肠杆菌、粪链球菌、溶血链球菌、溶组织梭菌等。目前，用于蛋白酶工业生产最主要的菌株及最重要的研发对象都是芽孢杆菌(地衣、枯草、短小芽孢杆菌等)。我国碱性蛋白酶的工业生产菌株有地衣芽孢杆菌2709、C1213、嗜碱性短小芽孢杆菌B4等；另外，一些能产生极端蛋白酶的极端细菌也越来越受到关注，Vidyasagar M等从极端嗜热古细菌的静止期培养液中分离纯化出一种分子量为68kDa的耐热碱性丝氨酸蛋白酶，该酶在60，pH 10.0，20NaCl中显示了最高的酶活性，在90一小时仍能保留80的酶活性。 1.2.2 放线菌灰绿放线菌、直丝放线菌、弗雷德氏放线菌都可以产生碱性蛋白酶。 Petrova DH等从热放线菌sp-21E中分离出的耐热丝氨酸胶原蛋白酶，在70能稳定一个小时， 最适作用pH 9.0-9.5。Lee JK等从热放线菌sp.21E中分离出的高热碱性蛋白酶最适pH11.0。在pH5.0-12.0相当稳定。1.2.3 真菌真菌产生的蛋白酶的种类比细菌更多。产生胞外蛋白酶的真菌有曲霉菌、青霉菌、链霉菌、镰刀菌、酵母菌等。许多曲霉菌都可以产生碱性蛋白酶。Pekkarinen AI等分离出镰刀菌产生的一种类胰蛋白酶，与农作物枯萎病的发生有重要关系：Larcher G等发现Scedosporium apiospermum能产生一种分子量约33000Da的丝氨酸蛋白酶；levleva EV等发现Fusarium culmorum fungus产生的胞外蛋白酶在pH 6.0-10.0范围内有着较高的生物学活性，SDS-PAGE表明该菌产生的蛋白酶至少有五种。 1.2.4 病毒 病毒蛋白酶与某些致死性疾病如AIDS、肿瘤的发生发展有着密切的联系。科学家们研究发现许多病毒都能产生丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶。如人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、森林脑炎病毒产生的蛋白酶的研究为疾病机制的探索和治疗提供了非常有意义的依据。 1.3 微生物蛋白酶的优点 微生物日益成为蛋白酶的主要生产来源其原因为：生长快，周期短；培养条件要求不高；微生物资源丰富等诸多优点，这些优点是其他动植物资源无法取代的。 (1) 微生物繁殖速度快、周期短。 细菌在合适的条件下20-30分钟就可繁殖一代，生长速度为农作物的500倍，动物的1000倍12。 (2) 微生物资源丰富，酶的品种齐全 在不同环境中生存的微生物有不同的代谢途径，可产生适应不同环境的酶分子，如低温酶、中温酶、高温酶、耐高盐酶、耐碱酶等。 (3) 微生物培养培养条件要求不高，方法简单易行。 微生物培养原料多为农副产品，来源丰富，机械化程度高，易于大批量生产，连续发酵生产可提供经济有效的产品。 (4) 微生物产生的蛋白酶多为胞外酶。与胞内酶相比，胞外酶具有诸多优点：首先，分离提取容易，且不必破碎细胞，因此省去了去除核酸的工艺；其次，胞外酶不受所获得的生物量的限制，因而获得较高的酶产量；再次，胞外酶的活性显现的最佳条件与产酶菌株的培养条件往往一致13。1.4 微生物蛋白酶的应用 用于微生物生产的商业酶已有百余种，但产量大、应用广、经济效益高的主要是各种水解酶。从经济学的角度看，蛋白酶要算最重要的一类工业酶了。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶多达80多种，其市场销售金额约占酶制剂销售总额的 60以上，广泛用于轻工、食品、环保、医药等方面。 1.4.1 在玉米加工中的应用玉米蛋白的疏水性使其食品功能特性极差，因此，用蛋白酶修饰玉米蛋白使其成为可溶性蛋白的研究成为热点。王梅谷等对碱性蛋白酶水解玉米蛋白的反应动力学进行了研究，探索了酶法修饰玉米蛋白的可行性。在适宜的反应体系中，可大幅度提高玉米蛋白的溶解量。近年来的研究还发现，许多天然蛋白质经过碱性蛋白酶水解后可获得对血管紧张素酶具抑制作用的活性肽。国内的的一些研究表明，利用蛋白酶加工玉米获得的玉米多肽能消除超氧阴离子，从而对急性酒精中毒所致的肝损伤具有保护作用。1.4.2 在食品工业中的应用 微生物蛋白酶在奶制品加工业、焙烤业、豆制品加工、蛋白水解物除苦味等食品工业有着非常广泛的应用。Ageitos JM等从藓样芽孢杆菌USC13中分离出一种凝乳酶，乳球菌产生的蛋白酶可用于奶酪的生产，米曲霉蛋白酶可用于面团发酵,黑曲霉菌的胞外脯氨酰蛋白酶可用于除去蛋白水解物的苦味14。 1.4.3 在动物饲料加工中的应用 动物饲料是以淀粉、蛋白质等生物大分子物质作为营养源。饲料添加的酶制剂可提高饲料的消化率和利用率15，并减少畜禽排泄物中的氮磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染。 1.4.4 在纺织行业中的应用 蛋白酶在羊毛的减量加工和丝绸精炼脱胶等方面具有广泛的应用，可解决羊毛仿羊绒物质的生硬、粗糙等问题，并能改善和提高丝绸与棉毛麻等纤维混纺产品的手感和风格，增加羊毛产品的价值。芽孢杆菌蛋白酶长久以来因其耐热性好、作用范围宽、具有较好的除污效果等特性而广泛用于纺织业。 1.4.5 在洗涤剂中的应用洗涤剂借助于生物酶使其质量和性能得到了全面发展。洗涤剂加入蛋白酶后具有以下优点： (1) 提高产品的去污效果，支持被洗衣物的原有色彩； (2) 减少了洗涤剂中表面活性剂及某些助剂的用量： (3) 增加了节水节能和环境保护的效益。 洗涤剂中酶的加入可减少洗涤次数、降低洗涤温度，而酶自身又是极易生物降解的物质。因此，加酶洗涤剂是最近十几年来的热门产品。较常用的有枯草杆菌丝氨酸蛋白酶等Saeki K等利用碱性芽孢杆菌KSM-K16生产的一种新型碱性蛋白酶KP-16，已应用于浓缩高效洗涤剂；另一产蛋白酶株KSM-KP43产生的碱性蛋白酶KSM-KP43能耐受化学氧化剂和表面活性剂，也已作为洗涤助酶实现了工业化生产。1.4.6 在皮革生产加工中的应用我国皮革资源丰富，皮革产业发展非常迅速。猪牛羊皮制革时须脱毛后才能进一步加工鞣制成革。蛋白酶可分解毛、表皮同真皮层连接处的蛋白质，从而使毛皮连接松开而脱毛。在猪皮加工的包酶阶段常用蛋白酶进行局部处理。Nilegaonkar SS等从蜡样芽孢杆菌MCM B-326中分离出的胞外蛋白酶可用以脱毛和水牛皮的加工。微生物角蛋白酶在脱毛和皮革加工中有着广泛的使用。1.4.7 在生产富含高营养注射用水中的应用美国利用了碱性蛋白酶在等电点溶解大豆提取高浓度蛋白水解质的工艺路线,获取的浓缩蛋白质高达70(干物质基础)。这种浓缩蛋白用于配制注射用生理盐水时，可获pH7.0的注射用盐水，营养学研究证明：人对大豆蛋白水解质的真正消化度达93，远高于大豆加工所得的其他蛋白质产品。该工艺在美国已得到普遍应用。1.5 国内外蛋白酶的研究状况及其前景 从国外研究动向上看，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过发酵条件优化和遗传育种、物理化学诱变或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。在酶的纯化手段方面，应用了亲和层析、等电点聚焦、分子筛等新技术16，快速而有效的获得理想的纯品，为蛋白酶底物特异性的研究提供了有利条件。 我国的蛋白酶研究近二十年来也取得了很大进展，与蛋白酶生产制备相关的产酶株的筛选、育种、发酵、诱变、工程菌构建与表达、酶的纯化与制备等技术日臻成熟。目前已生产和应用的蛋白酶品种有21种之多，广泛用于丝绸脱胶、皮革脱毛、毛皮软化、电影废胶片回收，生化药物生产以及用作医药、洗涤剂等。在基础研究方面，正在开展酶的纯化、以探索酶的作用机制、理化性质、更进一步弄清其对底物的特异性。但是，与国外相比，我国的蛋白酶研究还存在许多问题，如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一，价格昂贵，应用面还不够广等。 1.6 本实验的研究目的与内容本论文从以下几方面对蛋白酶高产菌株进行较为系统的研究：(1) 从土壤中筛选出蛋白酶高产菌株。(2) 对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。(3) 研究蛋白酶高产菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。第二章 实验材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验仪器表2-1 实验仪器仪器型号生产厂家电热压力蒸汽灭菌锅LDZX-40SBI上海申安医疗器械厂全温振荡培养箱HZQ-Q东联电子有限公司生化培养箱HPS-160哈尔滨东明仪器厂超净工作台SW-CJ-IF杭州净化设备公司电子分析天平FC204上海精密仪器厂低温离心机LG10-2.4A北京医用离心机厂pH测量仪PHSJ-4A上海精密仪器厂分光光度计711s上海光谱仪器有限公司水浴锅HH.SYZ1-N北京长风仪器有限公司微波炉LG韩国LG公司2.1.2 实验材料土样：采自山东理工大学附近农田土壤。主要试剂：表2-2 实验主要试剂试剂名称纯度生产厂家脱脂奶粉B.R.完达山乳业股份有限公司氯化钠（NaCl）A.R.天津市福晨化学试剂厂蔗糖A.R.天津市福晨化学试剂场碳酸钠A.R.青岛化学试剂厂酪氨酸A.R.北京经科宏达生物公司尿素B.R.莱阳市康德化工有限公司琼脂粉B.R.北京奥博星生物技术有限公司牛肉膏B.R.北京奥博星生物技术有限公司蛋白胨B.R.北京奥博星生物技术有限公司福林试剂A.R.上海世泽生物科技有限公司三氯乙酸A.R.天津市科密欧化学试剂有限公司结晶紫B.R.天津市福晨化学试剂厂磷酸氢二钠A.R.天津市凯通化学试剂有限公司磷酸二氢钠A.R.天津市化学试剂六厂干酪素A.R.上海浦江应用生物化学研究所培养基、种子斜面培养基牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂粉20.0g、水1000mL、121灭菌20min，备用。、筛选培养基牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂粉20.0g、脱脂奶粉25.0g、水1000mL、106灭菌6min，备用。、基础培养基牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、水1000mL、121灭菌20min，备用。试剂配制、0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g，定容至1000mL。、0.4mol三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸65.4g，定容至1000mL。、PH7.2磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液（A液）。称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000mL，即成1.2mol溶液（B液）。 取A液28mL和B液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1molpH7.2的磷酸缓冲液。、2酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至100mL即成。配置后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。、100ug/mL酪氨酸溶液：精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000ug/mL，在吸取此液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为100ug/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后液应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。、制作酪氨酸的标准曲线取6支25mL的比色管，编号，按下表操作表2-3 制作酪氨酸的标准曲线试剂管号123456蒸馏水，mL1086420100ug/ml酪氨酸，mL0246810酪氨酸最终浓度，ug/mL020406080100测定步骤：取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mol碳酸钠5mL，在各加入的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20min在72型分光光度计进行测定（波长660nm）。一般测三次，取平均值。将1-6号管所测得的光密度（OD）减去一号管所测得的光密度为净OD值17。为清楚起见，在列出表格如下（表2-4）。表2-4试剂管号123456按表1制备的不同浓度酪氨酸，mL1111110.4mol/L碳酸钠溶液，mL555555福林试剂，mL111111保温发色20min后进行光密度（OD值）测定以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线。2.2 实验方法2.2.1 菌株筛选富集：从学校附近的农田中采集土样 ,称取5g土样 ,放入装有45mL无菌水的三角瓶中 ,37震荡培养24h。初筛: 然后将富集培养的菌液取1mL,用无菌水稀释到10-5、10-6、10-7g/L分别在 10-5 、10-6 、10-7 g/L浓度下各取1mL土壤稀释液制成混菌平板 ,将培养皿放入37培养箱中培养24h.取出培养好的平皿,选择生长良好、形态明显的单菌落,用无菌牙签挑种到牛奶筛选培养基上 ,每个平皿中接4-5个,37培养箱中培养24h.挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落,接种到斜面培养基上,放入冰箱冷藏。复筛:从冰箱中取出初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37下恒温培养 24 h.各取1环,接种到装液量为20mL基础培养基的50mL三角瓶中,在37条件下摇床培养24h.分别取各菌株发酵液10L滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上 (直径为12mm),然后将培养皿放入37的培养箱中培养24h ,取出后测量水解圈直径与菌落直径.重复此过程3次,取平均值,选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株作为出发菌株whr118.原理：筛选菌株产生的蛋白酶能够分解菌落周围牛奶培养基中的酪蛋白，从而使菌落周围产生无色的透明圈。优点：利用牛奶筛选培养基，产生的透明圈清晰易辨，特别是它的灵敏度较高，只要菌落长到肉眼可见即可产生清晰的透明圈。2.2.2 革兰氏染色 取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌体于水滴边缘轻轻涂几下。 自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。 滴加结晶紫液，染一分钟。用水冲净结晶紫液。 滴加碘液冲净残水，并覆盖约1min。用水冲去碘液，将片上的水甩干。 滴加95%乙醇液脱色约2030s，并立即用水冲净乙醇。 用蕃红液染1-2min。用水洗净蕃红，风干，用显微镜油镜观察涂片。菌体红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。2.2.3 芽孢染色 加自来水与小试管中，用接种环从斜面上挑取1-2环培养18-24h的细菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。 加5孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 将此试管浸于沸水浴中，加热15-20min。 用接种环从试管底部挑取数环菌液于洁净的载玻片上，并涂成薄膜凉干，将涂片通过微火3次固定。 水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 加复红染液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干19。2.2.4 蛋白酶产生菌酶活力的测定酶活测定原理：酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。蛋白酶可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。酶液的制备： 从斜面培养基中取1环菌种于30mL基础发酵培养基中，在37、140rpm摇床上培养12h，再分别取1mL经12h培养的菌液于不同条件的液体培养基中培养24h，后将24h的培养液于5000r/min离心10min取其上清液为酶液。测定酶活方法：取25mL比色管3支，每管内加入酶液1mL，置于40水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取25mL试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40保温发色20min后进行光密度（OD）测定。空白试验也去试管3支编号（1）、（2）、（3），测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。为清楚起见，分别列出表格于下（见表2-5及表2-6）。表2-5试剂管号试剂管号123（1）（2）（3）预热酶液，mL111预热酶液，mL111预热2酪蛋白，mL1110.4mol三氯乙酸，mL222作用10min（精确计时）作用10min（精确计时）0.4mol三氯乙酸，mL222预热2酪蛋白，mL111表2-6试剂管号123（1）（2）（3）滤液，mL1111110.4mol/L碳酸钠溶液，mL555555福林试剂，mL111111保温发色20min后进行光密度（OD值）测定2.2.5 产酶条件优化产酶曲线测定：在50mL基础培养基中，分别在37140rpm下培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，测其酶活。不同碳源对产酶的影响：在50mL基础培养基中其他成分不变，选用5种浓度为1%的不同的碳源，分别为麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉，37 140 rpm培养最优时间，测其酶活。不同氮源对产酶的影响：在50mL基础培养基中加入最优碳源，氮源改用6种浓度为1.5%的不同的氮源，其他成分不变,分别是尿素、KNO3 、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37 140 rpm以最优时间培养，测其酶活。不同培养基初始pH值对产酶的影响：在50mL基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变,选用5种不同的pH，分别是pH=5、pH=6、pH=7、pH=8、pH=9，37 140 rpm以最优时间培养，测其酶活。不同温度对产酶的影响：在50mL基础培养基中加入最优碳源、氮源,其他成分不变，采用最优pH值，分别在31、33、35、37、39下140rpm以最优时间培养，测其酶活。不同装液量对产酶的影响：在基础培养基中加入最优碳源、氮源,其他成分不变，采用最优pH值、温度，分别在20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL装液量下140rpm以最优时间培养，测其酶活。第三章 实验结果及讨论3.1 实验结果3.1.1 目的菌株的分离纯化从土样中用牛奶筛选培养基中分离得到6株具有蛋白酶活性的菌株。选其中水解圈较大的whr1号菌株进行后续实验，并斜面保藏。 图3-1 菌种筛选 图3-2 菌种筛选 图3-3 菌种筛选 图3-4 菌种筛选 分别测量各菌株透明圈的直径与菌落直径，得下表：表3-1 六株菌株的透明圈比较菌株号Whr1Whr5Whr9Whr4Whr15Whr17透明圈直径（D）(mm)272424262325菌落直径（d）(mm)201920211922D-d (mm)7545433.1.2 菌株的形态特征对whr1号菌株分离纯化，在37培养24h后，观察单菌落，菌落呈透明乳黄色，湿润，菌落表面光滑，边缘形状不规则。革兰氏染色后，显微镜观察菌体呈蓝紫色，是阳性，菌体成直杆状。 图3-5 革兰氏染色 图3-6 芽孢染色3.1.3 蛋白酶酶活测定酪氨酸的标准曲线：表3-2 测酪氨酸的标准曲线的OD值100ug/mL的标准酪氨酸溶液(mL)020406080100OD00.2230.4470.6510.8831.111整理数据得： 图3-7 酪氨酸的标准曲线酶活定义：在40下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个酶活单位(U/mL)。酶活计算公式：酶活力(U/mL)=4*A*N/10式中：A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数； 44毫升反应液取出1mL测定； 10反应10分钟； N稀释酶液的倍数。3.1.4 不同培养时间对产酶的影响产酶曲线测定：在50ml基础培养基中，分别在37140rpm下培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，测其酶活。实验结果如下：表3-3 不同培养时间对产酶的影响时间(h)061218243036OD值0.0010.0250.0430.0980.1230.1170.032OD值0.0040.0190.0530.1000.1260.1210.033OD值0.0040.0250.0420.1050.1230.1070.037平均OD值0.0030.0230.0460.101