分子生物学课件重点整理朱玉贤（可编辑） .doc

分子生物学课件重点整理_朱玉贤 第二章 染色体与DNA染色体chromosome是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式是间期细胞染色质结构紧密包装的结果真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质 chromatin 的形式存在的染色质是一种纤维状结构叫做染色质丝它是由最基本的单位核小体 nucleosome 成串排列而成的原核生物 prokaryote DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核染色体由DNA和蛋白质组成蛋白质由非组蛋白和组蛋白H1H2AH2BH3H4DNA和组蛋白构成核小体组蛋白的一般特性P24进化上的保守性无组织特异性肽链氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上组蛋白的可修饰性甲基化乙基化磷酸化及ADP核糖基化等 H5组蛋白的特殊性富含赖氨酸24 鸟类鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5 组蛋白的可修饰性 在细胞周期特定时间可发生甲基化乙酰化磷酸化和ADP核糖基化等H3H4修饰作用较普遍H2B有乙酰化作用H1有磷酸化作用所有这些修饰作用都有一个共同的特点即降低组蛋白所携带的正电荷这些组蛋白修饰的意义一是改变染色体的结构直接影响转录活性二是核小体表面发生改变使其他调控蛋白易于和染色质相互接触从而间接影响转录活性2DNA1 DNA的变性和复性 变性Denaturation DNA双链的氢键断裂最后完全变成单链的过程称为变性 增色效应 Hyperchromatic effect 在变性过程中260nm紫外线吸收值先缓慢上升当达到某一温度时骤然上升称为增色效应融解温度Melting temperature Tm 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度 生理条件下为85-95影响因素GC含量pH值离子强度尿素甲酰胺等复性Renaturation 热变性的DNA缓慢冷却单链恢复成双链 减色效应Hypochromatic effect 随着DNA的复性260nm紫外线吸收值降低的现象 2 C值反常现象C-value paradox C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开这就是著名的C值反常现象 四核小体 nucleosome 用于包装染色质的结构单位是由DNA链缠绕一个组蛋白核H2AH2BH3H4 2的八聚体构成的 1原核生物基因组结构特点 基因组很小大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元 trnascriptional operon 多顺反子 polycistron 重叠基因由基因内基因部分重叠基因一个碱基重叠组成2真核生物基因组结构特点真核基因组结构庞大 3×109bp染色质核膜单顺反子基因不连续性 断裂基因interrupted gene内含子 intron 外显子 exon 非编码区较多 多于编码序列 91 含有大量重复序列 不重复序列单一序列在基因组中有一个或几个拷贝真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的如蛋清蛋白血红蛋白等 功能主要是编码蛋白质 中度重复序列在基因组中的拷贝数为101104如rRNAtRNA 一般是不编码蛋白质的序列在调控基因表达中起重要作用 高度重复序列拷贝数达到几百个到几百万个卫星DNAAT 含量很高的简单高度重复序列1 DNA的一级结构指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序 DNA序列是这一概念的简称碱基序列2特征双链反向平行配对而成脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA骨架碱基排在内侧内侧碱基通过氢键互补形成碱基对ATCG2DNA 的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构 2分类右手螺旋A-DNAB-DNA左手螺旋Z-DNA3DNA的高级结构指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构是一种比双螺旋更高层次的空间构象2主要形式超螺旋结构正超螺旋和负超螺旋一DNA的半保留复制semi-nservative replication1定义由亲代DNA生成子代DNA时每个新形成的子代DNA中一条链来自亲代DNA而另一条链则是新合成的这种复制方式称半保留复制3DNA半保留复制的生物学意义DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代二与DNA复制有关的物质1原料四种脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP 2模板以DNA的两条链为模板链合成子代DNA3引物DNA的合成需要一段RNA链作为引物4引物合成酶引发酶此酶以DNA为模板合成一段RNA这段RNA作为合成DNA的引物Primer 实质是以DNA为模板的RNA聚合酶5 DNA聚合酶以DNA为模板的DNA合成酶以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物反应需要有模板的指导反应需要有3 -OH存在DNA链的合成方向为5 3 性质 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性5 3 外切活性- 5 3聚合活性 中 很低 很高新生链合成-聚合酶主要是对DNA损伤的修复以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙聚合酶修复紫外光引起的DNA损伤聚合酶 DNA 复制的主要聚合酶还具有35外切酶的校对功能提高DNA复制的保真性6DNA连接酶1967年发现若双链DNA中一条链有切口一端是3-OH另一端是5-磷酸基连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键而使切口连接 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制损伤修复重组等过程中起重要作用7DNA 拓扑异构酶 DNA Topisomerase 拓扑异构酶使DNA一条链发生断裂和再连接作用是松解负超螺旋主要集中在活性转录区同转录有关例大肠杆菌中的蛋白拓扑异构酶该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA作用是将负超螺旋引入DNA分子同复制有关例大肠杆菌中的DNA旋转酶8DNA 解螺旋酶 解链酶DNA helicase 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA Ecoli中的rep蛋白就是解螺旋酶还有解螺旋酶IIIIIIrep蛋白沿3 5移动而解螺旋酶IIIIII沿5 3移动9单链结合蛋白 SSBP-single-strand binding protein 稳定已被解开的DNA单链阻止复性和保护单链不被核酸酶降解三DNA的复制过程大肠杆菌为例双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物填补缺口连接相邻的DNA片段1双链的解开- ftju制有特定的起始位点叫做复制原点 ori 或o富含AT的区段从复制原点到终点组成一个复制单位叫复制子复制时解链酶等先将DNA的一段双链解开形成复制点这个复制点的形状象一个叉子故称为复制叉双链解开复制起始P44大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性形成开链解链酶六体分别与单链DNA相结合 需DnaC帮助 进一步解开DNA双链2RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶引发RNA引物的合成引物长度约为几个至10个核苷酸3DNA链的延伸DNA的半不连续复制semi-discontinuous replication DNA复制时其中一条子链的合成是连续的而另一条子链的合成是不连续的故称半不连续复制在DNA复制时合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链合成方向与复制叉移动的方向相反形成许多不连续的片段最后再连成一条完整的DNA链为滞后链 在DNA复制过程中前导链能连续合成而滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短片段这些不连续的小片段称为冈崎片段4切除RNA引物填补缺口连接相邻的DNA片段复制终止当复制叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列Ter时Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB不再将DNA解链阻挡复制叉继续前移P47在DNA聚合酶催化下切除RNA引物留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上在DNA连接酶作用下连接相邻的DNA链四复制的几种主要方式 P421双链环状型复制双向等速2滚环型1模板链和新合成的链分开2不需RNA引物在正链3OH上延伸3只有一个复制叉3D环复制-单向复制的特殊方式如动物线粒体DNA五真核生物中DNA的复制特点1真核生物每条染色体上有多个复制起点多复制子约150bp左右2复制叉移动的速度较慢约50bp秒仅为原核生物的1103真核生物染色体在全部复制完之前各个起始点不再重新开始DNA复制真核生物快速生长时往往采用更多的复制起点4真核生物有多种DNA聚合酶5真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物真核冈崎片段长约100-200bp原核冈崎片段长约1000-2000bp六原核和真核生物DNA的复制特点比较复制起点ori原核一个真核多个复制子 原核一个真核多个复制子长度原核长真核短复制叉原核多个真核多个复制移动速度原核较快真核较慢真核生物染色体在全部完成复制前各起始点的DNA 复制不能再开始而在 快速生长的原核生物中复制起点上可以连续开始新的DNA复制原核生物染色体的复制与细胞分裂同步可以多次复制真核生物染色体的复制发生在S期是细胞分类的特定时期而且仅此一次四DNA的修复DNA修复系统功能错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核甘酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复SOS系统修复嘧啶二体或甲基化DNADNA的修复导致变异1错配修复 mismatch repairDam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺甘酸甲基化甲基化紧随在DNA复制之后进行几秒种后至几分钟内根据复制叉上DNA甲基化程度切除尚未甲基化的子链上的错配碱基2碱基切除修复 excision repair 所有细胞中都带有不同类型能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶它能特意切除受损核苷酸上的N-糖苷键在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点统称为AP位点一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺然后改变配对性质造成氨基转换突变腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对3核苷酸切除修复1通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3 DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4DNA连接酶将切口补平4 DNA的直接修复在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤防止G-T配对SOS反应 SOS response 是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下细胞为求生存而产生的 一种应急措施 包括诱导DNA损伤修复诱变效应细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等细胞癌变也与SOS反应有关两个作用1DNA的修复2产生变异五 DNA的转座DNA的转座或叫移位transposition 由可移位因子 transposable element 介导的遗传物质重排现象转座子transposon Tn存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位已经发现转座这一命名并不十分准确因为在转座过程中可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上在新位点上出现的仅仅是它的拷贝因此转座有别于同源重组它依赖于DNA复制原核生物转座子的类型1插入序列 IS IS是最简单的转座子不含有任何宿主基因它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分 2复合转座子 composite transposon 复合转座子是一类带有某些抗药性基因或其他宿主基因的转座子其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列 3TnA家族TnA家族没有IS序列体积庞大 5000bp以上 带有3个基因其中一个编码-内酰胺酶 AmpR 另两个则是转座作用所必须的 三转座作用的机制转座时发生的插入作用的普遍特征是受体分子中有一段很短的 3l2bp 被称为靶序列的DNA会被复制使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间对于一个特定的转座子来说它所复制的靶序列长度是一样的如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列而Tn3两端总有5bp的靶序列靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性DNA末端三转座作用的遗传学效应 p631转座引起插入突变2转座产生新的基因3转座产生的染色体畸变4转座引起的 生物进化反转录转座子retrotransposon指通过RNA为中介反转录成DNA后进行转座的可动元件第三章 生物信息的传递上 从DNA到RNA转录 transcription 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 参与转录的物质原料 NTP ATP UTP GTP CTP 模板DNA酶 RNA聚合酶其他蛋白质因子RNA合成方向5 到 3转录的不对称性在RNA的合成中DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板称为转录的不对称性与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链DNA分子上转录出RNA的区段称为结构基因转录单元transcription unit一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列二参与转录起始的关键酶与元件一 RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶大肠杆菌为例-全酶 核心酶 因子亚基基因相对分子量亚基数组分功能rpoA365002核心酶核心酶组装启动子识别rpoB1510001核心酶和共同形成RNA合成的活性中心rpoC155000111000需查1rpoD700001因子因子用于真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较 酶位置转录产物相对活性对-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶核仁rRNA50-70不敏感RNA聚合酶核质hnRNA20-40敏感RNA聚合酶核质tRNA约10存在物种特异性RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别RNA聚合酶DNA聚合酶大小 M 大48×105dol小109×105dol引物无有产物较短游离较长与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无5 33 5校对合成能力无有修复能力无有二 启动子 promoter 启动子定义指能被RNA聚合酶识别结合并启动基因转录的一段DNA序列 TATA区酶的紧密结合位点富含AT碱基利于双链打开 TTGACA区提供了RNA聚合酶全酶识别的信号 转录起点-与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基真核生物启动子的结构核心启动子core promoter定义指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的最少的DNA序列包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区作用选择正确的转录起始位点保证精确起始2上游启动子元件包括CAAT盒CCAAT和GC盒GGGCGG等作用控制转录起始频率三 转录起始复合物-二元闭合复合物二元开链复合物三元复合物原核三转录的基本过程1起始位点的识别RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程 RNA聚合酶全酶 2 与模板结合 2转录起始RNA聚合酶全酶 2 与模板结合DNA双链解开在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应形成转录起始复合物 5 -pppG -OH NTP 5 -pppGpN - OH 3 ppi转录起始复合物 RNApol 2 - DNA - pppGpN- OH 3 3RNA链的延伸 亚基脱落RNApol聚合酶核心酶变构与模板结合松弛沿着DNA模板前移在核心酶作用下NTP不断聚合RNA链不断延长注意9个核苷酸以前还在启动子区容易脱落一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区转录正式进入眼神阶段4转录终止 终止子terminator位于基因的末端在转录终止点之前有一段回文序列反向重复序列约6-20bp 真核生物终止 由一段特定序列5AATAAA3和回文序列反向重复序列组成 分为两类 强终止子内部终止子不依赖Rho 因子的终止 弱终止子 需要因子rho factor又称为依赖性终止子 Rho-dependent terminator不依赖 因子的终止当RNA链延伸到转录终止位点时RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键RNA-DNA杂合物分离转录泡瓦解DNA恢复成双链状态而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来这就是转录的终止终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区RNA形成发夹结构在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列RNA的3端为寡聚U发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来依赖 因子的终止 因子六聚体蛋白水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来从而终止转录二真核生物的转录过程1 转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化转录起始时RNA-pol不直接结合模板其起始过程比原核生物复杂1 转录起始前的上游区段 顺式作用元件 cis-acting element 影响自身基因表达活性的非编码DNA序列 例 启动子增强子弱化子等增强子在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列但不是启动子的一部分特点1远距离效应2无方向性3顺式调节4无物种和基因的特异性5具有组织特异性6有相位性7有的增强子可以对外部信号产生反应2 转录因子能直接间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质现已发现数百种统称为反式作用因子 trans-acting factors 反式作用因子中直接或间接结合RNA聚合酶的则称为转录因子 transcriptional factors TF 参与RNA-pol转录的TF -TFD TFATFBTFFTFETFH3转录起始前复合物 pre-initiation complex PIC 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合而需依靠众多的转录因子 4模板理论 piecing theory 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子转录因子之间互相结合生成有活性有专一性的复合物再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合转录相应的基因 2 转录延伸真核生物转录延长过程与原核生物大致相似但因有核膜相隔没有转录与翻译同步的现象 RNA-pol前移处处都遇上核小体 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象 3 转录终止 和转录后修饰密切相关四转录后加工5端加帽3端加尾RNA的剪接RNA的编辑1在5端加帽 5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸m7GpppmRNA5端的这种结构称为帽子cap帽子结构功能 能被核糖体小亚基识别促使mRNA和核糖体的结合 m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解增强mRNA的稳定23端加尾-多聚腺苷酸尾巴-AAUAAA准确切割加polyA多聚腺苷酸尾巴功能提高了mRNA在细胞质中的稳定性3RNA的剪接生物体内内含子的主要类型U-AGAU-AC类内含子类内含子类内含子参与RNA剪接的物质 snRNA核内小分子RNAsnRNP与snRNA结合的核蛋白 核内RNAU1U2 U4U5U64RNA的编辑编辑editing是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变加入或丢失等现象五原核生物与真核生物mRNA的特征比较1原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 单顺反子mRNA只编码一个蛋白质的mRNA多顺反子mRNA编码多个蛋白质的mRNAZ -半乳糖苷酶Y 透过酶A乙酰基转移酶ZYA为结构基因 5 端无帽子结构 3 端没有或只有较短的polyA 结构 SD序列原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列P85 2真核生物mRNA的特征基因的分子生物学定义产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列 5 端存在帽子结构多数mRNA 3 端具有polyA 尾巴组蛋白除外以单顺反子的形式存在六RNA合成与DNA合成异同点相同点1都以DNA链作为模板2合成的方向均为53 3聚合反应均是通过核苷酸之间形成的35-磷酸二酯键使核苷酸链延长不同点复制转录模板两条链均复制模板链转录不对称转录原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代双链DNA半保留复制mRNA tRNA rRNA配对A-TG-CA-UT-AG-C引物RNA引物无第四章 生物信息的传递下 从mRNA到蛋白质翻译指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则依次合成一条多肽链的过程蛋白质合成的场所是核糖体蛋白质合成的模板是mRNA模板与氨基酸之间的接合体是tRNA蛋白质合成的原料是20种氨基酸一遗传密码aa三联子一三联子密码mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码 triplet coden 至1966年20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清三遗传密码的性质1 连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读密码间既无间断也无交叉 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失可能导致框移突变 frameshift mutation 从mRNA 5 端起始密码子AUG到3 端终止密码子之间的核苷酸序列各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链称为开放阅读框架 open reading frame ORF 2简并性 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并degeneracy对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子synonymous codon3通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码从原核生物到人类都通用已发现少数例外如动物细胞的线粒体植物细胞的叶绿体4摆动性转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合在密码子与反密码子的配对中前两对严格遵守碱基配对原则第三对碱基有一定的自由度可以摆动这种现象称为密码子的摆动性 二tRNA的结构功能与种类一 tRNA的结构 1二级结构三叶草形2三级结构 L形二 tRNA的功能1解读mRNA的遗传信息2运输的工具运载氨基酸tRNA有两个关键部位 3端CCA接受氨基酸形成氨酰-tRNA 与mRNA结合部位反密码子部位 tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别把所带氨基酸放到肽链的一定位置1起始tRNA和延伸tRNA 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA其他tRNA统称为延伸tRNA真核生物起始密码子AUG 所编码的氨基酸是Met起始AA-tRNA为Met-tRNAMet原核生物起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身 而是甲酰甲硫氨酸起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet2同工tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA 同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码又要有某种结构上的共同性能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别P1193校正tRNA无义突变校正tRNA可以通过改变反密码子区校正无义突变错义突变校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上合成正常的蛋白质 无义突变在蛋白质的结构基因中一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子UAGUGAUAA使蛋白质合成提前终止合成无功能的或无意义的多肽这种突变就称为无义突变 错义突变由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子这种基因突变叫错义突变 GGA甘氨酸 AGA精氨酸四氨酰-tRNA合成酶AA- tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶它既能识别tRNA又能识别氨基酸对两者都具有高度的专一性三核糖体的结构与功能 核糖体是由rRNAribosomal ribonucleic acid和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的细菌是70s 50s30s 哺乳动物是80s 60s40s 二核糖体的功能合成蛋白质在单个核糖体上可化分多个功能活性中心在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能mRNA结合部位小亚基结合或接受AA-tRNA部位A位大亚基结合或接受肽基tRNA的部位大亚基肽基转移部位P位大亚基形成肽键的部位转肽酶中心大亚基 四蛋白质合成的过程 生物学机制氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工 一 氨基酸的活化原核生物中起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸 起始AA-tRNA是fMet-tRNAfMet真核生物中起始氨基酸是甲硫氨酸 起始AA-tRNA是Met-tRNAMet 二 翻译的起始原核生物细菌为例所需成分30S小亚基 50S大亚基模板mRNA fMet-tRNAfMetGTPMg2翻译起始因子IF-1IF-2IF-3翻译起始 翻译起始复合物形成 又可被分成3步 P1291 核蛋白体大小亚基分离230S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合3在IF-2和GTP的帮助下 fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对4带有tRNAmRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合GTP水解释放翻译起始因子真核生物翻译起始的特点核糖体较大为80起始因子比较多 mRNA 5端具有m7Gppp帽子结构 Met-tRNAMet mRNA的5端帽子结构和3端polyA都参与形成翻译起始复合物 真核生物翻译起始复合物形成 区别原核生物 原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合再与fMet-tRNAfMet结合最后与50S大亚基结合而在真核生物中40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合再与模板mRNA结合最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物P131 三 肽链的延伸肽链延伸由许多循环组成每加一个氨基酸就是一个循环每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合肽键的生成和移位延伸因子 elongation factor EF 原核生物EF-T EF-Tu EF-Ts EF-G真核生物EF-1 EF-2 1AA-tRNA与核糖体A位点的结合需要消耗GTP并需EF-TuEF-Ts两种延伸因子2肽键形成是由转肽酶肽基转移酶催化3移位核糖体向mRNA3端方向移动一个密码子需要消耗GTP并需EF-G延伸因子A位点是新到来的氨酰-tRNA的结合位点P位点是肽酰- tRNA的结合位点E位点是延伸过程中释放tRNA的位点即去氨酰-tRNA通过E位点脱出释放到核糖体外的胞质中四肽链的终止 RF1识别终止密码子UAA和UAG 终止因子 RF2识别终止密码子UAA和UGA RF3具GTP酶活性刺激RF1和RF2活性协助肽链的释放真核生物只有一个终止因子eRF 五 蛋白质前体的加工1N端fMet或Met的切除2二硫键的形成3特定氨基酸的修饰 磷酸化糖基化甲基化乙基化羟基化和羧基化4切除新生肽链中非功能片段六蛋白质折叠由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象从而表现出生物学活性或功能新生多肽一级结构二级结构三级结构已经具有活性对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性 七 蛋白质合成抑制剂青霉素四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用从而阻遏原核生物蛋白质的合成抑制细菌生长被广泛用于人类医学氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合又能与真核生物核糖体结合妨碍细胞内蛋白质合成影响细胞生长氯霉素有时也用于治病但剂量和周期受到较严控制五蛋白质的运转机制1翻译-运转同步机制2翻译后运转机制 1 线粒体蛋白质跨膜运转 2 叶绿体蛋白质的跨膜运转3核定位蛋白的运转机制4蛋白质的降解蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开蛋白质需要运转核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质细胞核线粒体和内质网等各个部分补充和更新细胞功能细胞各部分都有特定的蛋白质组分蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行 细胞中蛋白质的合成绝大多数在细胞质中合成一小部分在细胞器叶绿体和线粒体中合成定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成细胞器内合成的留在细胞器内蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转protein translocation蛋白质运转的两种方式翻译-运转同步co-translational translocation 是即将进入内质网的蛋白质的易位方式 蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合 蛋白质合成时核糖体定位于内质网表面称膜结合核糖体 membrane-bound ribosome 分泌蛋白质大多是以同步机制运输的翻译后运转post-translational translocation蛋白质翻译完成后从核糖体上释放然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合蛋白质合成时其核糖体不与任何细胞器相连称游离核糖体 free ribosome 在细胞器发育过程中由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的参与生物膜形成的蛋白质依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内蛋白性质 运转机制 主要类型 分泌 蛋白质在结合核糖体上合成并以翻译-运转同步机制运输免疫球蛋白卵蛋白水解酶激素等细胞器发育 蛋白质在游离核糖体上合成以翻译后运转机制运输 核叶绿体线粒体乙醛酸循环体过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质 膜的形成 两种机制兼有 质膜内质网类囊体中的蛋白质 1翻译-运转同步机制信号肽假说信号肽能启动蛋白质运转的任何一段多肽常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列有时不一定在N端绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽信号序列特点1一般带有10-15个疏水氨基酸2在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸3在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链丙氨酸或甘氨酸信号肽假说内容1蛋白质合成起始首先合成信号肽2SRP信号识别蛋白与信号肽结合翻译暂停3SRP与SRP受体结合核糖体与膜结合翻译重新开始4信号肽进入膜结构5蛋白质过膜信号肽被切除翻译继续进行6蛋白质完全过膜核糖体解离信号肽与蛋白质转运的关系P1441完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件2仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生3信号序列切除并不是转运所必需4并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽蛋白质翻译运转同步运输的基本过程 可分两个阶段首先带有新生肽链的核糖体与膜结合然后新生肽链进入膜通道并易位 核糖体与膜结合需要信号识别颗粒signal recognition particle SRPSRP有两种能力结合新合成的分泌型蛋白的信号序列结合位于膜上的 SRP 受体2翻译后运转机制前导肽及其特性 翻译后跨膜易位的蛋白质前体一般含前导肽 leader peptide 前导肽在跨膜运转中起重要作用 过膜后前导肽水解蛋白质变为有功能的蛋白质前导肽的一般特性1带正电荷碱性氨基酸Arg较丰富 分散于不带电荷的氨基酸序列之间2缺少带负电荷的酸性氨基酸3羟基氨基酸Ser含量较高4有形成两亲亲水和疏水- 螺旋能力线粒体蛋白质跨膜运转Hsp70为分子伴侣分子伴侣结合在一些不完全装配或不恰当折叠蛋白上帮助它们折叠或防止它们聚集的蛋白质 分子伴侣的生物学功能 1 帮助新生蛋白质正确折叠 2 纠正错误折叠或介导其降解泛素活化酶 ubiquitin - activating enzymeE1 泛素结合酶ubiquitin - conjugating enzymeE2 泛素蛋白连接酶 ubiquitin -proteinligating enzyme E3 E1E2E3的作用 E1激活泛素分子 E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上 E3能识别被降解的蛋白质 第五章 分子生物学研究法重组DNA技术-基因工程 分子杂交及相关技术聚合酶链式反应的原理和应用DNA多态性及其检测基因操作主要包括DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析以及基因的人工合成定点突变和PCR扩增等基因工程指在体外将核酸分子插入病毒质粒或其他载体分子构成遗传物质的新组合使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分1理论上的三大发现遗传物质主要是DNA DNA的双螺旋结构和半保留复制机制 遗传密码子的破译2技术上的三大发明限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片断 质粒改造成载体以携带DNA片断克隆 逆转录酶的使用常用的工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基载体 vector自我复制克隆载体表达载体原核载体质粒 pBR322pUC噬菌体M13真核载体动物病毒载体pLXSN载体的条件 分子小