SDSPAGE电泳技术.doc

4.4 试剂和溶液（以下所用试剂均为分析纯级）4.4.1 纯化水4.4.2 A液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：称取18.17g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.8，加纯化水定容至100ml。4.4.3 B液（30%丙烯酰胺）：称取29.1g丙烯酰胺，0.9 g N,N-甲叉双丙烯酰胺于100ml烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤，避光4保存。4.4.4 C液（10%SDS）：称取 10g SDS于100ml烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml。4.4.5 D液：10%过硫酸铵溶液（4保存有效期为3个月）。4.4.6 E液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：称取12.11g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8，加纯化水定容至100ml。4.4.7 电极缓冲液母液（5×），称取15.1g Tris，94.0g甘氨酸，5.0g SDS加800ml纯化水溶解，用6mol/L盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。4.4.8 电极缓冲液，量取200ml电极缓冲液母液，加700ml纯化水稀释，再用6 mol/L 盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。 4.4.9 供试品缓冲液，称取0.303g Tris，0.189ml盐酸，4ml甘油，0.002g溴酚蓝，0.8g SDS，加纯化水定容至10ml，此溶液用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2ml -巯基乙醇；4保存。4.4.10 考马斯亮蓝染色液，称取1.25g考马斯亮蓝R-250，250ml甲醇，50ml冰醋酸，加纯化水溶解至500 ml。4.4.11 考马斯亮蓝脱色液，量取150ml 95%乙醇，75ml冰醋酸，加纯化水至1000 ml。4.5 操作过程 4.5.1 制备分离胶（凝胶浓度15%）首先检查玻璃板是否洁净，如有污垢，需重新用纯化水洗净后用吹风机吹干至室温后再用。将长短两片玻璃板相对而放，长玻璃板有间隔条的一面面向短玻璃板，两玻璃板放在灌胶框里夹紧，并确保两玻璃板下边缘在同一个水平面上，将装有玻璃板的灌胶框安放在灌胶架上。一块胶的配方量：用移液枪取纯化水0.95ml、A液1ml、B液2 ml、C液0.04ml、D液0.025ml、TEMED 0.004ml于烧杯中，混匀，立即灌胶，并用11.5ml纯化水封顶端，垂直放置约30min。4.5.2 制备压缩胶 分离胶凝固后（观察凝胶界面应平直，否则为不合格分离胶，不能使用），倒去上层水，并用吸水纸吸干。配压缩胶，取纯化水1.4ml，B液0.33ml，E液0.25ml，C液0.02ml，D液0.02ml，TEMED 0.008ml，混匀，灌胶，并插入样品梳，放置约40min。填写凝胶配制记录（附件）。凝胶编号方法为年份两位数月份日期各两位数及当天配胶流水号两位数。4.5.3 样品处理变性纯化：将“上样液”、“穿透液”、“洗脱液”三个样分别与还原缓冲液按11、31、12的比例混匀，沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心。沉淀溶解液：将样品与还原缓冲液按13比例混匀，沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心。复性纯化：将“上样液”、“冲洗液”、“洗脱液”分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按11比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心，非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟，8000rpm×1min离心。原液：将样品分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按12比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心；非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟，8000rpm×1min离心。成品：将样品分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按12比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟。4.5.4 加样待浓缩胶聚合后拔出样品梳，将电泳缓冲液注满电泳槽，在加样孔中加入4.5.3所处理的样品，原液、成品上样量为1015 g，变性纯化中“上样液”、“穿透液”、“洗脱液”分别为20µg、20µg、10µg，沉淀溶解液上样10µg，复性纯化中“上样液”、“洗脱液”上样量15µg，“冲洗液”1µg左右，若“冲洗液”无蛋白则用非还原缓冲液代替。4.5.5 电泳接通电源，一块胶：以恒流30mA开始电泳，至待检样品进入分离胶后将电流调至60mA，直至电泳结束；两块胶：以恒流60mA开始电泳，至待检样品进入分离胶后将电流调至120mA，直至电泳结束。4.5.6 染色电泳结束后将玻璃板取出，用纯化水将电泳槽冲洗干净，然后将凝胶取下，放入电泳染色液中，用微波炉档火力加热约1分钟，放在摇床上摇动约10分钟。玻璃板用纯化水充分洗净，放在架上自然晾干。4.5.7 脱色将凝胶从电泳染色液中取出，用纯化水冲洗后，放入电泳脱色液（一块胶约200ml）中，用微波炉档火力加热约1分钟，之后放在摇床上摇动15分钟，更换脱色液3次，直至脱去背景颜色，再将凝胶转入水中。4.5.8 干胶为保留永久性记录，可将染色的凝胶用Bio-Rad干胶膜制成胶片保存。我们实验室的SDS-PAGE改良集锦】蛋白SDS-PAGE电泳及定量在蛋白质技术手册基础上，根据实验条件的方便修改。请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室5年验证。【一】 储存液配制（均4冰箱保存，用完放回）（1）2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25) 500 mL：121 g Tris base加350 mL双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约1 min，缓慢加入浓盐酸（11.8 M）20 mL，继续搅拌均匀，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入适量双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱保存。（2）100 g/L SDS 溶液： 10 g SDS （要求高纯度，其质量明显影响电泳效果）加100 mL双蒸水，于洁净的250 mL烧杯中进行微波加热溶解，注意不要爆沸，间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解，完全溶解后的溶液应清澈透明无色。倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱保存。冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。（3）75%（v/v）甘油：于500 mL量筒中倒入分析纯甘油300 mL，加双蒸水100 mL，以一次性塑料手套封口，颠倒量筒使甘油完全溶解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱保存。（4）10 g/L 溴酚蓝溶液：500 mg溴酚蓝加双蒸水50 mL，搅拌溶解，倒入棕色玻璃试剂瓶中，4 冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上层澄清液，不要吸到沉淀。【二】电泳工作液配制（均4冰箱保存，用完放回）（1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500 mL：于800 mL洁净的烧杯中，依次称取双丙烯酰胺4 g，丙烯酰胺146 g，缓慢倒入双蒸水约350 mL，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。完全溶解的溶液应清澈无色透明。待溶解完全后补加双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱可保存10个月。（2）4×分离胶缓冲液，500 mL：于500 mL洁净的量筒中，依次加入375 mL 2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25)， 100 g/L SDS 溶液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化）20 mL，最后加入适量双蒸水至500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱最少可保存12个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊，微波略微加热使其澄清后即可使用。（3）100 g/L 过硫酸铵溶液 (ammonium persulfate, AP)20 mL：2g过硫酸铵加20 mL 双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4冰箱最少可保存10个月。注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分装到4个无色塑料试剂瓶中分别保存。（4）TEMED 成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母液受到污染。（5）5×样品缓冲液，100 mL：依次加入50 mL 75%（v/v）甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (实测pH8.9±0.1，25)，5 mL巯基乙醇，9 mL双蒸水。混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4冰箱至少可保存12个月。可分装成10 mL使用，不会使母液受到蛋白污染。（6）10×电泳缓冲液，1000 mL： 称取10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品）于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL溶解，可微波炉加热（< 80）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可，间歇用玻璃棒搅拌。分装至无色玻璃试剂瓶中，室温最少可保存6个月。其pH值约为pH 8.4±0.1。【注意可省去pH6.8的浓缩胶缓冲液，用4×分离胶缓冲液pH8.9的替代即可】【三】12% 电泳胶的配制要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以枪头搅拌约10-20 sec，灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的水层（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37凝固15-30 min。而在配胶时浓缩胶只加前三个组分，混合液要于4冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入AP和TEMED溶液，枪头搅拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于37凝固15-30 min。凝固的胶连带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密包裹可在4冰箱保存2-4天，长时间保存易干胶，要重新做胶。12% 电泳胶的配制（10 mL）Table  12% Gel componentsReagents                           Seperating gel                    Condensing gel二块                30% Acr-Bis solution            4    mL                                    0.67   mL4×seperating gel buffer        2.5   mL pH8.9                       1    mL pH8.9H2O                                    3.5   mL                                 2.3    mL100 g/L AP                           50   L                                    30    LTEMED                                 5    L                                    5     L4块                30% Acr-Bis solution             8    mL                                  1.35   mL4×seperating gel buffer         5    mL pH8.9                         2     mL pH8.9H2O                                    7    mL                                   4.6    mL100 g/L AP                             100   L                               60    LTEMED                                   10    L                               10    L六块                30% Acr-Bis solution             12    mL                             2.1    mL4×seperating gel buffer         7.5    mL pH8.9                    3     mL pH8.9H2O                                       10.5   mL                         7     mL100 g/L AP                             150   L                            90    LTEMED                                   15    L                             15    L-其他浓度的电泳胶配制-A% 电泳胶的配制（10 mL）                                     Table  A% Gel components（10 mL）-Reagents                           Seperating gel                    Condensing gel二块                30% Acr-Bis solution      （A% *10mL）/30% mL              0.67   mL4×seperating gel buffer        2.5   mL pH8.9                       1    mL pH8.9H2O                                    补足10mL                               2.3    mL100 g/L AP                           50   L                                  30    LTEMED                                 5    L                                    5     L-其中的H2O   补足10mL，所用的计算公式为：10mL-2.5mL- （A% *10mL）/30% mL 。例如6%的配方中，30% Acr-Bis solution     2 mL   H2O                          5.5 mL     例如12%的配方中，30% Acr-Bis solution     4 mL   H2O                         3.5 mL    例如15%的配方中，30% Acr-Bis solution     5 mL   H2O                         2.5 mL-【四】 考马斯亮蓝快速染色和脱色（极其好用！）考马斯亮蓝染色液 1000 mL：先称取考马斯亮蓝R250  1.0 g  于1000 mL试剂瓶内，加入甲醇450mL溶解，再加冰醋酸100 mL和双蒸水450 mL至大约1000 mL。室温可放置12个月以上。染色液可倒入专用的回收试剂瓶，届时加入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10 g/L的三氯乙酸后可重复使用。考马斯亮蓝脱色液 10 L：于10 L洁净塑料桶内装入工业乙醇2 L，冰醋酸500 mL，加入去离子水至10 L，混匀，室温可放置12个月以上。蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色：凝胶的染色和脱色于合适体积的塑料盒中进行。电泳后的凝胶加入染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70 sec至染色液刚刚沸腾（注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸出），然后于脱色摇床上继续染色约10 min即可。染色液请倒入专用的回收容器内。以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至刚沸腾后于染色摇床上摇动约10 min，倒掉脱色液，此时凝胶的蛋白条带即可看清。重复以上脱色步骤一次，即可看清电泳条带。扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色，这需要重新换上脱色液室温摇床脱色2 h以上。【五】  蛋白上样量的选择要根据具体情况决定，对于考马斯亮蓝染色，如果样品为菌体蛋白样品，有至少50条以上的条带要显出来，需要上样量在15 g左右即可，如果蛋白条带少于6条，如蛋白Marker或纯化阶段后期的蛋白样品，上样量可减少至2 g即可显出清晰的条带。【简化成大肠杆菌上样，大约等于5.0个OD600上样10-15 uL左右】【本内容由华东理工大学鲁华生物技术研究所提供，尊重作者劳动成果，转帖请注明】