DU730紫外可见分光光度计的应用研究.doc

现代科学仪器Modern Scientific Instruments第4期2010年8月No.4 Aug. 2010141DU-730紫外/可见分光光度计的应用研究张燕婉叶珏宋莉孟宪敏 中国医学科学院阜外医院中心实验室 北京 100037 摘要发表此文章的目的是向读者介绍一台国际先进水平的光谱仪器美国BECKMAN贝克曼公司生产的DU-730紫外/可见分光光度计它性能优良、应用广泛、操作简便是生物医学实验室中非常实用的计量仪器。本文首先阐述了DU-730紫外/可见分光光度计的结构和原理 特别是这台仪器具有的先进的“微聚焦光束技术”。然后介绍了仪器的各种主要技术参数重点讨论了仪器的功能和所涉及的应用领域包括:全波长扫描、固定波长测定、单一组分分析和蛋白质核酸的生物学测定等。最后作者为加强仪器的管理阐述了仪器的正确使用方法与维护为正在应用这台仪器的读者提供一些有用的经验。关键词紫外/可见分光光度计微聚焦光束技术原理应用使用与维护中图分类号TH744.12Zhang Yanwan1 Ye Jue1 Song Li1 Meng Xianmin1Core Laboratory of Fuwai Hospital for CardiologyChinese Academy of Medical Sciences Beijing 100037ChinaAbstract The objective of this paper is to introduce a spectral instrument with international advanced level DU730 UV/Vis spectrophotometer from BECKMAN Inc. This instrument is provided with excellent property extensive applica-tion and convenient manipulation and is measuring instrument practically in biomedical laboratory. Firstly this paper had elaborated the structure and principle of DU730 UV/Vis spectrophotometer and “ advanced technique of micro-focused beam” particularly. Still this paper introduced chief technical parameter of the instrument. The function and applied eld of this instrument was discussed weightily including wavelength scan determination of fixed wavelength single componet analysis biological determination of protein/nucleic acid and so on. Finally the correct manipulation and maintenance of DU730 UV/Vis spectrophotometer had been elaborated to intensify instrumental management. The authors have provided the helpful working experience for users with this spectrophotometer. Key words UV/Vis spectrophotometer micro-focused beam principle application manipulation and maintenance收稿日期2009-12-15作者简介张燕婉女主任技师研究领域生物技术仪器分析实验室管理紫外/可见分光光度计作为一种分子吸收光谱仪广泛应用于化学研究、生物医药、环境科学和食品分析等研究领域。它具有分析精度高、应用范围广、分析简便快速和仪器灵敏度较高的优点1是目前大多数实验室常用的定量分析仪器。分光光度计所采用的分光光度法在定量分析领域中的应用已有数十年的历史至今仍是实验室中最常用的分析方法之一。随着现代科学仪器的不断发展在传统的追求准确、快速、可靠的同时小型化、智能化、在线化、网络化成为了现代紫外/可见分光光度计新的增长点2。本文重点介绍的美国BECKMAN公司的DU-730紫外/可见分光光度计是目前最具先进性的全波长分光光度计。BECKMAN公司研发紫外/可见分光光度计历史悠久产品的性能优良长期以来一直受到用户的好评。近年推出的DU-730型分光光度计又以崭新的面貌吸引着广大用户以它先进的“微聚焦光束技术”micro-focused beam 适应当今飞速发展的生物医学研究的需要向更微量、更灵敏的分析技术尖端迈进。1 DU-730紫外/可见分光光度计的结构和原理1.1结构组成DU-730分光光度计的基本组成和大多数分光光度计一样都是由光源、单色器、比色池、光电检测器和放大器几部分组成。1.1.1光源DU-730分光光度计的紫外/可见区的光源Modern Scientific Instruments142No.4 Aug. 2010仍是采用卤素钨灯和氘灯。卤素钨灯的工作波长范围为:3202500nm氘灯的工作波长范围为180375nm。两光源有仪器上的一个灯选择反射镜自动进行选择和光源切换。1.1.2单色器分光系统单色器是分光光度计的重要部分比滤光片选择波长能更有效地提供带宽窄的单色光。DU-730是采用先进的光栅单色器由入射狭缝、出口狭缝、色散元件、准直镜等光学元件组成。入射狭缝是用来调节入射单色光的纯度和强度也直接影响分辨率。而准直镜反射凹面镜的作用一是将入射光束变为平行光束后再进入色散元件二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出口狭缝上形成光谱像。出口狭缝是单色光的出口它只让光谱带中所需要波长的光从狭缝中透出而将其他波长的光挡住不让其通过3。色散元件是单色器中的核心元件起着将复合光分解为单色光的作用。DU-730分光光度计的色散元件是凹面反射式全息光栅它本身就起着分解复合光和准直镜聚焦的作用而且全息光栅具有杂散光小、不产生伪线和分辨率高的优点。1.1.3比色池DU-730分光光度计配有多种规格样品池架和比色杯。池架有标准池架、七位池架、50L微量池架和多形态样品池架。比色杯有常量24mL、半微量0.51mL和微量50100L使用方便。另外还配有样品架卡套分为特为酶动力学设计的半导体温控池:温度范围1550和流动池。1.2工作原理图1 DU-730分光光度计光路图及各光学元件入射狭缝氘灯灯选择镜钨灯反射镜光栅参考元件滤光片分流镜出射狭缝比色池透镜旋转比色池架测量元件单色器DU-730分光光度计的工作原理与其他分光光度计基本相同。由光源发出的复合光经反射镜进入单色器的入射狭缝经准直镜变为平行光束投射到色散元件-光栅上分解为单色光。测定所需要的波长的光经滤光片轮的选择后从出口狭缝中穿出经反射镜反射聚焦透射入比色杯中。此时特征波长的光被样品溶液吸收掉与其互补色的光透过比色杯照射在光电检测器上光信号被转变为电信号经放大、数据传输、保存到测量结果的显示。BECKMAN公司的DU-730分光光度仪的先进之处在于:在做微量分析时当光束进入比色杯池前采用了该公司的专利技术“微聚焦光束技术”可以集中光源于样品上避免光量的流失因此不论是使用标准池还是50L的微量池仪器都能准确的进行测定大大提高了仪器检测的灵敏度和结果的精密度。如下图所示:图2 微聚焦光束技术与传统光束技术的比较从上图可以看出“微聚焦光束技术”不同于普通的微量分析。聚焦的光源能量全部穿过样品中没有损失。而普通的微量分析存在光能量的损失高达80降低了仪器检测的灵敏度和重现性。UD-730分光光度计就是通过采用国际先进的“微聚焦光束技术”克服了在微量分析时存在的光能量损失的技术问题大大提高了做微量分析时仪器的检测灵敏度跃居光谱分析仪的国际领先地位。2DU-730分光光度计的主要技术参数2.1光学设计a 光源:钨灯和氘灯b 微聚焦光束技术c 光束的大小:0.5×2.2mm。2.2检测参数a波长范围:1901100nmb波长精度:±1nmc波长重现性: ±0.1nmd光学读数:-0.3003.000d光学精度: ±0.005A于0.00.5A143第4期2010年8月张燕婉 等DU-730紫外/可见分光光度计的应用研究3DU-730分光光度计的应用领域DU-730分光光度计不仅包括了普通分光光度计的单一波长测定还引进了先进的计算机技术将单一组分的定量分析和蛋白质/核酸的生物学分析程序化并具有数据传输、保存等软件功能。3.1单一波长测定Fixed Wavelength在这一分析模式里我们可以选择不同波长对样品的吸光值A进行测定然后将A值代入公式直接计算出样品中某种组分的含量。这个功能是分光光度计应用最多很多生物活性物质的含量分析试剂盒法大多采用单一波长测定来计算组分的浓度。这种测定方法简便、快速、实用 只测定吸光值不用做标曲深受实验室中广大研究者和技术人员的欢迎只要方法灵敏度足够、发色基团稳定、仪器的精密度高单一波长测定法还是较理想的一种定量分析方法。下表列出了目前我室利用DU-730分光光度计开展的检测项目。 表1 应用分光光度计开展生化检测列举检测项目检测方法 参考测定值临床意义超氧化物歧化酶总活力T-SOD测定 黄嘌呤氧化酶法人血清20100U/mL反应机体抗自由基氧化能力丙二醛MDA含量测定硫代巴比妥酸法TBA人血清210 nmol/mL反映机体脂质过氧化程度一氧化氮NO浓度测定硝酸还原酶法猪血清540mol/L较准确反映机体NO水平一氧化氮合酶NOS活力测定催化精氨酸法猪血清TNOS:1530U/mL结构型NOS活力能反映血管内皮细胞功能3.2全波长扫描Wavelength ScanDU-730分光光度计具有扫描功能。当我们要建立方法或了解样品的特征吸收峰在的确切波长时需要对样品进行一定范围的波长扫描利用这一功能来优化仪器的灵敏度。仪器可以同时记录扫描图形和扫描数据并保存图形和数据扫描结束后可以方便的对样品的扫描图形进行分析找出最大吸收波长既可以对已知方法进行验证又能对方法进行优化常在建立检测方法时应用。3.3单一组分分析Single Componet Analysis单一组分分析也是分光光度计很有用的一个功能它能准确定量出样品中某种组分的含量但需要有标准溶液。用这一分析模式进行测定时先要通过对一系列已知浓度的标准溶篨值进行测定读出一系列响应值Y吸光值 由已知浓度X值和响应值Y计算出线性方程YbXa仪器自动计算出给出线性方程的斜率b、截距a、CV值等参数 然后利用该回归方程求出未知样品的浓度值4。当测定未知样品时仪器能自动给出浓度值非常快速准确。此模式多用于组织或细胞的生化物质蛋白、维生素、盐离子等浓度测定等。3.4动力学/时间分析Kinetic/Time Mode这一新增的分析模式扩大了分光光度计的应用范围。借助于分光光度计法可以得出一些化学反应速度常数5过去是手工一个点一个点的测定的酶促动力学读数而今天已经是全程自动化分析大大解放了劳动力更适应当今科学发展的需要。目前我室已经开展线粒体密度的实时测定技术例如:当我们在研究细胞损伤时可以通过对细胞内的线粒体通透性转换孔mTPT的测定来判断线粒体受损后的肿胀程度进而推测细胞的损伤程度。实际操作就是:通过测定线粒体在高糖溶液中的透光率T的改变即当心肌细胞发生病理改变时回开放mPTP使线粒体发生肿胀样品的透光率就会下降监测线粒体溶液的透光率动态曲线下降的情况就直接反映出线粒体的水肿情况间接地反映了细胞的损伤和凋亡这对研究细胞的损伤和保护提供了有科学的实验证据。这是我们实验室目前已经开发出来的功能并在博士研究生“术中心肌细胞保护的数学模型研究”课题中取得了满意的结果。3.5蛋白质浓度测定用紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度的历史已由来已久但现代的分光光度计法测蛋白质浓度已经实现计算机程序化能快速、方便进行样品的蛋白浓度检测。DU-730分光光度计能用多种方法测定蛋白浓度如:Bradford法、Lowry法、紫外吸收法和目前国内外普遍采用的BCA法可以根据自己的实验室条件和需要选择分析模式。Modern Scientific Instruments144No.4 Aug. 20103.6核酸分析DU-730分光光度计除能测定多种生化物质含量还能进行核酸的生物学分析。这里包括:dsDNA、ssDNA和RNA浓度测定以及有关核酸的其他分析如:核酸的纯度、延伸盒系数、融解温度Tm等方便快速。4DU-730分光光度计的使用与维护4.1正确使用分光光度计DU-730分光光度计操作简便。打开仪器电源开关仪器应顺利通过自检然后预热10分钟左右可以进行测定。读数时应记录最先显示的数值不要让样品连续光照时间太长动力学测定除外特别是在紫外区域测定时更要快速因为随着光的连续照射读数会下降变得不稳定。而应用显色剂显色后会使读数稳定 给测定带来方便同时还会使物质中许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万明显提高了检测灵敏度5。4.2显示屏的维护DU-730分光光度计的显示屏比较特殊它既是数据显示屏又是仪器的操作键盘即触摸屏。为为避免刮伤操作时不能用手指、笔头等硬物触摸要用软布如棉签点触。显示屏被弄脏时可用水浸湿的软布轻轻擦拭不要用有机溶剂擦拭。4.3比色杯的使用和维护比色杯是光线通过样品池的重要元件特别是它投光的两面光学窗被污染或腐蚀将直接影响测定结果。测定时样品量一定要按不同规格的比色杯的要求加够规定的体积如:用微量杯样品量时样品量不能少于50L用常量杯时样品量不能少于2mL这样才能读数准确结果真实。每次测定结束时应及时用蒸馏水清洗比色杯至少三遍倒置晾干后放入干燥洁净的盒中保存如玻璃平皿。因为如果忘记冲洗残留的样品液蒸发后会沉淀于杯窗上影响透光。最好测定结束后将比色杯放在蒸馏水中浸泡将里外都冲洗干净千万不要放在去污剂中那样会腐蚀光学材料最好用专门的清洗剂Trick-klean。清洗时应注意一定不要用刷子刷玻璃透光面。如果上述较温和的清洗剂水、中性去污剂还不能洗掉沉淀在玻璃上的污物可自行配制以下一种清洗剂6非常好用:乙醇:3mol/L盐酸溶液 11体积比将脏的比色杯放入上述盐酸-乙醇溶液中浸泡注意:仅浸泡20秒钟即可立即用蒸馏水冲洗掉倒置晾干。 在使用比色杯时应特别注意防止光学面的材料被污染和腐蚀。无论是测定样品还是清洁剂都避免使用强碱性、浓无机酸和挥发性溶剂因为它们会形成一层薄膜进而腐蚀比色杯的光学面降低比色杯的透光性引起光的散射。4.4定期检定分光光度计属于实验室计量仪器的一种按国家标准7必须定期检定进行量值溯源。只有定期检定才能确保仪器波长的精确度从而才能保证测定的准确性同时还能及时发现仪器存在的问题。参考文献1 张燕婉叶珏时娜孟宪敏.实验室常用计量仪器的使用与维护.中国医学装备200961:49-512 倪一黄梅珍袁波赵海鹰窦晓鸣.紫外可见分光光度计的发展与现状.现代科学仪器20043:3-73 张玉海等编著.新型医用检验仪器原理与维修.电子工业出版社北京20051654 李秀兰关皑菁. 紫外可见分光光度计的测量不确定度分析.中国卫生检验杂志2003136:7657665 吴文铭.紫外可见分光光度计的及其应用.生命科学仪器200974:61-636 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