ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统.doc

ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统使用说明书第一部分 ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统简介1、系统原理32、组成部件及相关功能43、应用领域、特点、效益44、检测注意事项及操作步骤.45、ATP快检系统使用注意事项及故障排除.96、对应关系曲线.107、有关食品安全和卫生检测的问答.118、具体样品检测的操作方法及方案.14第二部分 ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统使用说明1、技术参数及性能.232、仪器操作说明.2421开机、初始化.2422参数设置.24221选择RLU方式.25222选择其它样品名方式.25223设置文件类型. .26224设置日期时间. .27 225设置检测时间.27226 U盘格式化.2723测试.2724查询.28241查询测试结果.282411删除测试结果292412删除文件.29242查询文件信息.30243查询仪器信息.30244查询电池电量.30245快速查询.30 25通讯323、上位机软件.3331软件安装3332驱动程序的安装3633软件启动3834软件运行3935样品及回归方程设定4036 “文件名”说明4137文件、记录操作和数据库424、电池充电 .435、保修.43第一部分 ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统简介1、系统原理萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂萤火虫荧光素酶（简称虫光素酶，luciferase）、虫荧光素（D-luciferin）以及所有细胞生物都产生的生物能量物质三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下： ATPD-LuciferinO2 Mg+ AMPOxyluciferinPPiCO2Light Luciferase上式表明，只要具备适当条件，不仅萤火虫，即使在试管中也能发出荧光。当反应系统中，虫光素酶和虫荧光素处于过量的情况下，荧光的强弱取决于ATP的数量。以检测含细菌的样品为例，细菌细胞越多，ATP量越高，发出的荧光也就越强。由于虫光素酶对ATP的反应非常灵敏，荧光强弱可通过荧光仪1015秒内计量。所以，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP的含量，从而确定细胞数量，因此，此系统为半定量快速检测系统。 维持胞内ATP浓度的相对恒定，是ATP在细胞代谢中发挥中心作用的关键。每个细胞的ATP量与胞内容积成正比，但ATP量与菌落形成单位（colony-forming units=cfu）之间却常常偏离这种关系，主要原因是样品中细菌细胞与细胞碎片彼此聚集成团，这种效应曾在大肠杆菌培养物这种单一菌群模式系统中有过描述，一个菌落有可能由单个或几个细胞扩增形成；另一种原因是检测者没有对样品作适当的预处理，比如没有去除胞外游离ATP。根据相关文献记载，不同种类细菌中的ATP含量不同，由于细菌ATP含量都处于10-18mol数量级，细微差别忽略不计，均值约为2.5×10-18mol。对于同种细菌，影响细胞内ATP含量的因素也很多，生长阶段、培养基种类、有氧无氧以及代谢抑制物的存在，都会影响细胞数和荧光值的对应关系。实测表明处于同一生长状态和批次样品中的ATP是相对恒定的，即在同一环境中微生物种类及生长情况固定，其ATP含量也相对恒定。2、组成部件及相关功能2.1 试剂组，按检测操作顺序分为：（1）体细胞裂解试剂（TRA），能专一而有效地裂解样品中的非细菌细胞（主要为体细胞）并释出ATP，然后通过过滤比色杯底部的滤膜将其排除。（2）细菌细胞裂解试剂（XRA），能专一而有效地裂解样品中细菌细胞并释出ATP。（3）荧光反应试剂组（LLR），能与细菌ATP相互作用并有效地发出荧光。（4）物表清洁度检测试剂组（SCR），能与物体表面ATP相互作用并有效地发出荧光。2.2 微量荧光检测仪（也称微量光度计），准确计量检样的荧光值。2.3 可供100次测定的样品预处理耗材。（1）过滤比色杯的杯架一个，用于固定过滤比色杯。（2）加压器一个，用于加压、排出体细胞ATP和试剂组。（3）带滤膜荧光反应比色杯100个，为荧光反应容器。（4）专用无菌吸水纸，置于过滤比色杯架，吸收加压后流出的液体。（5）带密封圈专用无菌浓缩器，用于浓缩样品。（6）自备微生物学无菌操作所需常规用具、器皿，样品采集无菌、无ATP的容器、塑料袋、手套、镊子等。3、应用领域、特点、效益使用ATP荧光法细菌快检仪实施食品、饮料、乳品加工等全程卫生学监测生产程序监测内容加工生产前生产设施清洁、消毒效果检测，原、辅料细菌总数检测，以保障原料质量或明确原料品质级别。加工生产过程中生产设备关键控制点（例如供水、通风阀门）卫生学监测，影响乳品发酵饮料、酒类特殊微生物总数检测。加工生产后制成品污染细菌总数检测。废弃物排放、环境、人员卫生学及细菌总数检测。4、检测注意事项及操作步骤4.1 试剂的准备和注意事项：4.1.1 本公司提供的“ATP荧光法细菌总数快检系统”所含试剂组与微量荧光检测仪需匹配使用，不可用其它试剂替代。4.1.2 LLR试剂（含萤火虫荧光素酶和D-荧光素）应在冰箱冷冻室-20中贮存，有效期6个月。LLR试剂组易变质，室温下不高于25时不得超过24小时，在0-4有效期为5天。4.1.3试剂（LLR）在用于检测前按规定低温存放，检测前20分钟取出平衡到室温方可应用。如果超过有效期，应弃用，重新购置。体细胞裂解试剂（TRA）及细菌细胞裂解试剂（XRA）可处于室温下保存， 2-8下保存效果最佳。4.1.4，萤火虫荧光素酶对ATP极其敏感，生物材料容易引起ATP交叉污染，所以检测应尽量满足微生物学常规无菌操作，才能取得准确、真实的检测数据。4.2样品采集和预处理简介非生理条件下，细菌细胞的ATP浓度将急速下降，但也同样拥有快速补偿机制以维持胞内ATP浓度相对稳定，保障生命活动正常进行。因此，在采集细菌样品或进行预处理时要注意下列事项。4.2.1.为避免离心浓缩一类非生理状况的步骤出现，可使用注射器将样品转移到一次性滤膜上。如需洗涤细胞，应用无菌、无ATP的PBS缓冲液淋洗，以免影响胞内ATP浓度。4.2.2.卫生监测时，常用涂抹法或用棉拭子擦拭采集样品，但此法对于有生物膜结构的细菌并非最佳方式，其一，细胞收集率不高；其二，棉花纤维干扰光检测。可改进为用滴瓶将ATP提取液滴加到待检表面，用海绵签收集ATP后进行光检。 4.2.3.细胞的ATP含量与细胞大小成正比，体细胞和酵母细胞的ATP含量大约分别是细菌细胞的1000倍和100倍，但ATP量和菌落形成单位（cfu）之间常常偏离这种关系，理论上每个活细胞都形成一个菌落，而实际上细胞彼此聚集常常出现二个或几个活细胞形成一个菌落的情况。4.2.4.样品预处理。可用ATP降解酶如三磷酸酶（apyrase）去除非细菌ATP，用温和的去污剂如TritonX-100去除样品中体细胞ATP，也可使用上述两种制剂同时处理。不同试剂的处理效果因样品而异，试剂的选择和搭配需经实验确定。4.3 检测样品的预处理：（操作过程中需配戴一次性无菌手套）必须用无菌、无ATP的PBS溶液：磷酸二氢钾34g；1mol/L氢氧化钠溶液175mL；蒸馏水825mL；pH7.2；使用时将上述溶液吸取1.25ml，定容至1000ml，灭菌后备用。实验室标准菌：在室温条件下用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样品细胞3次，最后用1ml同种PBS缓冲液悬浮样品细胞。物表清洁程度：将无菌棉签头部用TRA试剂润湿，在10cm×10cm范围内进行涂抹，涂抹时需不断旋转棉签头部，用1ml PBS缓冲液（不含钙、镁离子）浸泡棉签头部，从PBS缓冲液中吸出50l待测。液体样品：纯净水、自来水等细菌含量较低的样品需按比例浓缩；牛乳、果汁等浓度较大无法通过滤膜洗涤的样品需按比例稀释，稀释液应使用PBS（如使用国标生理盐水，检测数值会偏低）。液体被检样品含细菌细胞数若高于1000cfu/ml，可直接抽取50µl被检样品进行测试；液体被检样品含细菌细胞数若低于1000cfu/ml，应进行浓缩处理。浓缩方法如下：打开专用浓缩器，用无菌镊子取无菌过滤比色杯放入专用浓缩器内，注意上下胶圈放好，以免浓缩样品时发生泄露，拧紧浓缩器。用一次性无菌医用针管抽取10ml或其整倍数的被检样品，接到专用浓缩器上进行浓缩，用适当的压力缓缓地往下推注射器的柱塞（此时被检液体样品中的细菌被过滤比色杯的微孔滤膜截留，液体部分通过滤膜被排出）直到注射器与浓缩器中的液体部分完全被推出；拧开浓缩器，用消毒过的镊子从浓缩器中取出过滤比色杯备用。固体样品处理：无菌操作称取25g被检固体样品溶于225mlPBS溶液中，然后把处理好的悬浊液用灭菌后的滤纸进行粗滤，抽取过滤后基本澄清无肉眼可见悬浊物液体进行测试。（注：溶于PBS后所测结果为每克样品稀释10倍后所得光值）。特殊样品处理：如需检测高盐、高糖、深加工产品，含抑菌剂、色素类样品需增加TRA洗涤次数，洗涤5次为佳。冷藏或冷冻样品中微生物所含ATP会降低，如需检测冷冻的肉类、面食等，需使样品完全解冻至室温后再进行检测。4.4 ATP标准曲线制定步骤4.4.1用双蒸水将浓度为1mM的ATP溶液，按1：10梯度比例制备成100µmol、10µmol、1µmol、100nmol、10nmol及1nmol系列溶液。4.4.2用微量移液器吸取50µl荧光反应试剂组（LLR），加入荧光反应比色杯中，然后分别加入5µl稀释后的各梯度ATP溶液，用微量荧光检测仪检测RLU值，重复上述步骤，得到系列ATP溶液数据。4.4.3以RLU值为纵座标，对应ATP浓度系列为横座标作图。在1nmol-1µmolATP浓度范围内，ATP浓度与相应RLU之间存在线性关系。标准ATP溶液可以作为鉴定LLR试剂组是否失效及失效程度的阳性对照。如按4.4.2步骤加入1nmolATP溶液时RLU值低于200，表示开始失效，应弃用。4.5 样品检测步骤：4.5.1开机4.5.1.1打开仪器电源前，拉开仪器抽屉，确保抽屉小槽内清洁无异物，关闭抽屉。4.5.1.2打开电源，进行初始化及参数设置。（详见操作说明 ） 测 试 查 询参数设置通 讯4.5.1.3准备测试时，返回到主菜单界面（如下图），光标移动到“测试”选项。4.5.2试剂组本底的测定4.5.2.1取出比色杯架，中间垫放5张专用吸水纸，将未放置样品的过滤比色杯放入架孔内。4.5.2.2拿起TRA体细胞裂解试剂，向杯中滴加4滴，再用加压器置杯顶加压，排出杯中所有液体，由吸水纸吸净。重复上述步骤一次。4.5.2.3拉开抽屉后，屏幕显示准备测试状态（如下图）。从杯架上取下过滤比色杯置于仪器可拉动抽屉小孔内。 准备测试4.5.2.4拿起XRA细菌细胞裂解试剂，垂直滴加2滴于杯中。4.5.2.5用移液器从LLR试剂瓶吸取荧光反应试剂50µl加入杯底，缓和地吸挤三次混匀。关闭抽屉，开始测试。（注意：加入LLR试剂后，反应已经开始，所以操作应该迅速，务求操作时间一致，对样品测试达到平行数据十分关键。测量完毕前不可再拉动抽屉。）4.5.2.6本底空白RLU读数应低于200，如读数过高，则提示过滤比色杯或试剂有污染。4.5.3样品测定4.5.3.1取出比色杯架，中间垫放5张专用吸水纸，将含浓缩后样品的过滤比色杯放入架孔内（不需浓缩的液体样品用移液器直接吸取被检样50µl注入过滤比色杯内进行测试）。4.5.3.2拿起TRA体细胞裂解试剂，向杯中滴加4滴，再用加压器置杯顶加压，排出杯中所有液体，由吸水纸吸净。重复上述步骤一次。4.5.3.3拉开抽屉后，屏幕显示准备测试状态（如下图）。从杯架上取下过滤比色杯置于仪器可拉动抽屉小孔内。 准备测试4.5.3.4拿起XRA细菌细胞裂解试剂，垂直滴加2滴于杯中。4.5.3.5用移液器从LLR试剂瓶中吸取荧光反应试剂50µl加入杯底，缓和地吸挤三次混匀。关闭抽屉，开始测试。（注意：加入LLR试剂后，反应已经开始，所以操作应该迅速，务求操作时间一致，对样品测试达到平行数据十分关键）4.5.3.6根据“参数设置”所选测定模式，屏幕显示相应的测试结果。4.6 清洁程度标准快速制订步骤：4.6.1确定质控点和关键质控点。4.6.2清洁产品表面，重复二到三次以到达最佳清洁度。4.6.3建议结合平皿计数和RLU值设定自己的初始化数值。4.6.4连续几天在不同位置进行ATP卫生监控检测，得出2050个结果。计算这些RLU数值的平均值和标准偏差（s.d）。4.6.5计算通过标准RLU平均数值。4.6.6将通过标准数量增加2到3倍即为不合格值。4.6.7警告值介于合格与污染值之间。 4.6.8定期重新计算以更新限定值，不断提高标准。5、ATP快检系统使用注意事项、故障排除5.1 ATP快检系统使用注意事项：5.1.1检测完毕后，须将微量荧光检测仪做适当清洁以免下次使用时交叉污染。仪表外部可用干净的微湿布巾擦拭，可拉动抽屉可用沾有少许异丙醇或酒精的棉签擦拭。5.1.2为保持检测工作台不受污染，可用75%医用酒精擦拭桌面，或在超净台内操作。5.1.3操作时要戴一次性无菌手套，或用75%医用酒精擦拭双手以免试剂、台面污染。5.1.4临用前套上无菌移液管尖，使用移液器吸取或转移试剂、样品时务求准确，避免移液器与样品或试剂交叉污染。5.1.5完成检测后，立即取下过滤比色杯。未取出前，避免晃动或倒置微量荧光检测仪以免杯内试剂溅出污染光学部件。5.1.6冷藏或冷冻样品将导致其中微生物（细菌）细胞ATP量变化明显，应于避免，或待完全解冻平衡至室温后再做检测并设置对照。5.1.7高盐、高离子、高糖或高油脂组份将干扰ATP检测，重复加入体细胞裂解试剂（TRA）可改善。5.2 故障排除：故障可能原因排除方法在无过滤比色杯或样品情况下，可拉动抽屉推入后，仍显示高背景读数1、抽屉被样品污染2、光敏部件有误1、用酒精擦抽屉去除污染2、更换或检修测光仪有样品的可拉动抽屉推入后无读数1、电池电量不足2、断电3、可拉动抽屉关闭不严1、如显示电池电量不足，需充电2、查对供电情况3、重新关闭抽屉给出的读数显著低于应有读数1、试剂过期，失效 2、加入LLR试剂后没有立即关闭抽屉读数3、样品经冷冻或冷藏后使其中的细菌细胞内ATP量显著降低1、及时更换试剂2、更换样品，重新试验读数3、待样品及试剂恢复到室温后再测定6、对应关系曲线6.1 ATP浓度和相应荧光值（RLU）关系曲线 与分别表示采用本公司提供的微量荧光检测仪及美国New Horizons公司PROFILE-1-3560微量荧光检测仪所得结果。分别以log相对荧光值（RLU）、logATP浓度（atto mol）值为纵坐标和横坐标作图（y = 0.8362x + 1.175，R2= 0.9866）。上图表明，在ATP浓度为1pmol1nmol范围内，ATP浓度与RLU呈线性关系。6.2 不同浓度多种细菌混合物荧光值和相应细胞数关系曲线图、分别表示三批次不同浓度大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌培养物的混合物，进行平皿计数和相对荧光值检测（本公司微量荧光检测仪），并分别以log相对荧光值（RLU）和log平皿计数值（cfu/ml）为纵坐标和横坐标作图。由上述关系图推演的RLU-CFU（相对荧光值对应细菌菌落总数）可供参考。7、有关食品安全和卫生检测的问答一问：哪些因素可能影响食品安全和卫生？生物（如细菌总数超标、致病菌污染等）、化学（农药残留、有毒添加剂等）、物理（放射污染等）及转基因产品（有害遗传效应等）四大因素。其中，以细菌污染食物、饮用水引发食源性中毒最为常见，其危害的范围最广。二问：国内外通常采用什么方法进行食品细菌总数和卫生、防疫检测？“常规法”和“ATP荧光快检法”。常规法是我国卫生部规定至今仍然沿用的方法，因此，又称“国标法”，即（细菌）活细胞平皿计数法。三问：“常规法”和“ATP荧光快检法”的共同点和主要差别是什么？两种方法都能用于检测样品中的细菌总数，提供有关卫生防疫数据。主要差别在“时效性”，常规法至少要12天才能得到结果，快检法能在15分钟内得到实时检测数据。四问：为什么两种方法在“时效性”上有这样大的差异呢？因为它们所依据的基本原理各不相同。“常规法”是让检样中原先看不见的细菌细胞，在稀释涂布后通过在营养琼脂培养基上37，48小时的保温培育，这样，一个活的细菌细胞经多次分裂繁殖形成数以亿计，肉眼可见的细菌集群（菌落），然后通过计数得到结果，即菌落形成单位/毫升（克）CFU/ml（g）。“ATP荧光快检法”则基于虫光素酶能催化细菌细胞的ATP发出荧光，荧光检测仪能快速、准确计量荧光值的原理。因此，检样中细菌细胞越多，ATP量就越大，发出的荧光就越强。这样，在排除检样中非细菌ATP干扰的情况下，检测荧光值（RLU）就能确定细菌的细胞数CFU/ml（g）。五问：两种检测方法哪一种更准确？两种检测方法得到的数据一致吗？在回答这一问题前，让我们重温微生物学的两个基本概念：细菌或微生物对人类生活，生产造成的有利（如用于抗菌素生产）或有害影响（如污染食品、引发疾病）都非单一或少数细菌细胞的作用，而是单位体积内数以十万、百万细胞群体的效应。其次在适宜条件下，细菌每2030分钟就能分裂繁殖一代。以大肠杆菌为例，10万个细胞/毫升二小时后就成了640万细胞/毫升。因此，正确的回答是，两种方法都能满足特定时期细菌总数检测和卫生监测的需求，但时效性有重大差异。快检方法更有利于保障食品安全水平的全面提高。通过常规法和ATP荧光快检法实际检测建立一个两者之间可以互相参照，符合食品安全卫生标准的有效范围（如合格、警告、不合格）是发达国家的通用做法。六问：在食品安全方面国外有哪些值得借鉴的经验和措施？上世纪90年代后，美、英、日等国就已依据萤火虫发光原理，研制并推广使用ATP荧光法快检设备用于检测食品细菌总数或卫生防疫监测。这些设备既能提供实时的检测数据，又有准确、便携、使用容易等特点。不仅弥补了“常规法”时效性差的不足，又能发挥防患于未然的预警作用。有效地保障了食品安全总体水平的提高，也促进了如HACCP等食品卫生理念的诞生。七问：HACCP认证体系的主要涵义和作用是什么？HACCP是“危害分析关键控制点”一词的英语缩写，源于上世纪70年代美国太空总署提出的有关食品安全基本理念，即（1）危害食品安全的可能因素包括生物（转基因产品）、化学、物理四个方面；（2）从原料到食品通常经历加工生产产品包装、储存、运输配发销售等环节；（3）食品原料的品质、生产环境、设施、操作人员的卫生水平都将影响终产品食品的安全卫生水平。因此，只有将所有可能影响食品安全的危害因子全部纳入监控范围，采用快检方法实施监控才能从源头开始，从而有效地保障食品，并留有补救时间防患于未然。美、日、欧盟等国已将实施HACCP认证体系列为法定措施。我国卫生部已于2002年颁发食品加工企业的HACCP实施指南卫法监发174号。八问：“ATP荧光快检法”和实施食品安全的HACCP预警、溯源管理制度有何关系？在建立和推广使用ATP荧光法快检技术前，只能靠目测或平皿计数法评估产前或清洁消毒后生产线、食品接触表面的卫生水平。这两种方法要不是灵敏度不够，就是取得结果的时间太长，无法满足生产的实际需要。换一句话说，只有采用ATP荧光法快检一类方法才能实施HACCP和食品安全的溯源和预警制度。九问：美、日、欧盟各国如何评价ATP荧光快检法和建立相关检测标准？通过ATP荧光快检法得到的是来自食物残渣和微生物细胞两个部分ATP的总值。多数情况下，来自微生物细胞的比例较小。但是，由于食物残渣既是微生物生长的培养基，又起抵消灭菌效果的作用。因此，关键在确定避免重新污染的ATP临界值，而非单纯依据细菌细胞ATP值折算的细菌菌落数（cfu）。这就是多数卫生监测试剂盒不设置通用ATP标准，也不必期望ATP与CFU之间有确定相关关系，容易引起初用者疑虑的原因。统计结果证实，凡ATP荧光法显示卫生水平改善，则平皿计数结果也一定改善。如果检测点ATP水平高，即便是无菌的，次日早上必然大量滋生细菌导致食品污染。因此，发达国家的普遍做法是：首先通过ATP快检步骤对食品原料及经过清洁、消毒后食品原料接触表面是否达到卫生标准作出有数字依据的评价。其次，对易于引发微生物污染的关系部位实施重点监控。最后，制订出符合本单位情况，又符合卫生要求的ATP数值范围。十问：具备什么条件有利于在我国普遍实施HACCP认证体系？（1）发展拥有我国自主知识产权的食品安全关键技术，提供准确、有效、便携、操作容易、价格能为国内广大用户接受的食品安全检测设备和试剂系统。（2）建立与快检技术相匹配的国家、企业检测标准。（3）普及与快检技术相关的卫生学和卫生监督指导新理念、新知识。8.具体样品检测的操作方法及方案饮用水细菌指标ATP生物荧光快速检测法和分级判定（草案）1 范围本标准规定了饮用水细菌指标ATP（三磷酸腺苷）生物荧光快速检测法的术语和定义、试验方法、细菌指标的分级及判定。本标准适用饮用水细菌指标的现场快速检测。2 术语和定义2.1相对发光值 RLU （relative light unit）样品与试剂反应经微量荧光检测仪检测后，所显示在仪器上的读数。3 原理在有氧的条件下，虫光素酶催化D-荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下： ATPD-LuciferinO2 Mg2+ AMPOxyluciferinPPiCO2Light Luciferase当反应系统中，虫光素酶和D-荧光素处于过量的情况下，荧光的强弱取决于ATP的数量。以检测含细菌的样品为例，细菌细胞越多，ATP量越高，发出的荧光也就越强。在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP的含量，通过测量相对荧光值从而快速得知被检饮用水的细菌指标。4试验设备和材料4.1微量荧光检测仪：量程范围0-1010cfu/mL实际检测灵敏度（ATP）5×10-18mol检测时间1秒-99秒自由设定精确误差±5%由仪器生产厂家采用稳定的C14放射源进行定标、校准可检波长300nm650nm4.2试剂组，按检测操作顺序分为：体细胞裂解试剂：主要成份是非离子去污剂及表面活性剂，能专一而有效地裂解样品中的非细菌细胞（体细胞）并释出ATP，然后使用过滤比色杯底部的滤膜将体细胞裂解试剂、体细胞碎片及游离ATP排除，试剂可室温保存。细菌细胞裂解试剂：主要成份是阳离子去污剂及表面活性剂，能专一而有效地裂解样品中细菌细胞并释出ATP，试剂可室温保存。荧光反应试剂组：主要成份是D-荧光素、虫荧光素酶、镁离子，能与样品中的细菌ATP相互作用并发出荧光,20低温避光贮藏。4.3样品预处理耗材。过滤比色杯的杯架一个，用于固定过滤比色杯。加压器一个，用于加压、排出体细胞ATP和体细胞裂解试剂。带0.45m滤膜荧光反应过滤比色杯，为荧光反应容器。专用无菌吸水纸，置于过滤比色杯架，吸取加压后流出的液体。带密封圈无菌浓缩器，用于浓缩样品。自备微生物学无菌操作所需常规用具、器皿、样品采集无菌、无ATP的容器、塑料袋、手套、镊子等。5 分析步骤5.1打开微量荧光检测仪电源，使微量荧光检测仪进入系统初始化。5.2饮用水的浓缩处理：用注射器从样品中取出10ml的待测饮用水。打开微量荧光检测仪检查过滤比色杯读数为0后，将过滤比色杯放入无菌浓缩器内，并使注射器接到浓缩器上，用适当的压力缓缓推下注射器柱塞，直到注射器中的溶液推净。用消毒过的镊子从浓缩器中取出过滤比色杯，放在垫有吸水纸的过滤比色杯架上。5.3样品检测步骤：5.3.1取出过滤比色杯架，底层垫放5张专用无菌吸水纸，并将带滤膜比色杯放入架眼内，用移液器吸取检样50µL注入杯底。检测前打开荧光检测仪电源，此时液晶显示屏显“0”值。5.3.2将体细胞裂解试剂向杯中滴加4滴，加压器置杯顶加压，使杯中非细菌ATP、游离ATP通过底部滤膜排出，由吸水纸吸净。重复加压步骤一次。5.3.3将细菌细胞裂解试剂向杯中滴加2滴，取下比色杯置于可拉动抽屉内。5.3.4用移液器从荧光反应试剂瓶吸取荧光反应试剂50µL加入杯底，缓和地吸挤三次，混匀反应液。（关闭抽屉）5.3.5设置检测时间为10s，屏幕显示的相对荧光值（RLU）对照标准进行合格及不合格判定。6细菌指标分级及判定分级及判定见表1。RLU洁净度分级判 定400清 洁合 格4011000警 告不 合 格1000污 染ATP生物荧光快速检测卫生学方面监测（草案） 卫生监测方面检测可以使用中西公司生产的ATP荧光法餐饮具及清洁度快检试剂。范围、术语和定义、原理、试验设备和材料参照“饮用水细菌指标ATP生物荧光快速检测法和分级判定”。简易操作如下：（1）带上一次性无菌手套，打开餐饮具清洁度快检试剂包装袋（铝膜复合包装），取出1根无菌棉签，并掰下一个透明检测杯，注意不要污染杯内白色检测膜。（2）取无菌棉签，在棉签头部滴加5滴细菌细胞释放剂(XRA)，使棉签头部湿润，然后用此棉签在被测处横竖往返均匀涂擦,并随之转动棉签，采样总面积100cm2。（3）将透明检测杯放入可拉动抽屉小孔内，再向棉签头部滴加1滴细菌细胞释放剂(XRA)后置于透明检测杯中的白色检测膜上，使液体全部被吸收。（4）立即关闭抽屉，进行测试操作。操作应该迅速，务求试验操作时间一致以得到平行测试数据。测量完毕前不可再拉动抽屉。（5）屏幕显示相应的测试结果。RLU洁净度分级判 定300清 洁合 格301-900警 告不 合 格900污 染ATP荧光法应用于化妆品微生物的比对试验方案根据国外知名ATP快检企业Celsis在其网站上提过的相关资料可以知道，当检测化妆品时使用Rapiscreen系统一般需要24-48小时，这个过程主要是一个微生物的富集和增殖的过程。通过24小时增殖的过程可以检测到1 cfu/g的微生物，所以微生物的污染程度很低的时候理论上低于1000cfu/g就有必要进行这种富集和增殖的过程。对于低微生物污染的情况一般的富集和增殖的过程只需要简单的三个步骤：把样品用培养基稀释成(1% - 10% w/v)，可根据国标1：10进行稀释。在32培养箱中培养18-24小时，具体时间根据样品判定标准和试剂灵敏度确定。经过培养后取均匀的50微升用ATP荧光法进行检测。进行样品微生物富集和增殖的培养基也是关键，培养基要能保证适合各种微生物生长并且能够中和样品中的防腐剂和去污剂成分，同时培养基本身的ATP背景要保证非常低。Letheen牌的改良肉汤培养基是个不错的选择，如果没有可用国标法的培养基进行扩增培养。先用LLR试剂检测国标法的培养基如果ATP背景较高，则需要用apyrase处理使本底降低。目前国标法中和剂为卵磷脂和吐温80。1 实验仪器试剂1.1 样品：市面上销售的化妆品，每个样品都需有无菌对照样品1.2 仪器和试剂1.2.1 仪器 ATP生物发光快速检测系统配套仪器，包括：BLW0401微量光度计、过滤比色杯、高压灭菌锅、恒温培养箱、电子天平、1ml移液枪及枪头。1.2.2 试剂发光反应试剂（LLR）、细菌细胞ATP释放试剂（XRA）、卵磷脂吐温80营养琼脂培养基、液体石蜡和吐温80、PBS缓冲液。卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼 脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL现在有商售的，可直接加水配制。卵磷脂、吐温80营养液体培养基成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH 值为7.17.4，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，储存于冷暗处备用。0.5氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）成分：TTC 0.5g蒸馏水 100mL溶解后过滤，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4冰箱备用。2 实验方法 取化妆品10g置于灭菌的锥形瓶中，用培养基稀释成(1% - 10% w/v)，可根据国标1：10进行稀释， 对于油包水型化妆品还应加液体石蜡和吐温80 助溶剂，充分震摇样品使其充分混合均匀，在32培养箱中培养18-24小时。2.1 平板菌落计数法按照化妆品卫生规范（2007年版）中菌落总数的检测方法进行检测。2.2 ATP荧光法2.2.1用移液枪抽取50l样品加入到过滤比色杯；2.2.2再滴加2滴XRA；2.2.3用移液枪加50l LLR，推入仪器抽屉读数。3 实验结果3.1 平板菌落计数法根据化妆品卫生规范（2007年版）中微生物检验法总则中的相关菌落计数方法进行平板菌落的计数。3.2 ATP荧光法的标准确定将ATP荧光法测的荧光值与相应的菌落计数法所得的数值进行比较，初步确定出ATP荧光法检测化妆品菌落总数的判定标准。然后再通过3-4个批次的ATP荧光法检测结果与国标法得到的细菌数进行比对来修正判定标准。ATP荧光法应用于乳品微生物的应用指南一、背景资料ATP荧光法细菌总数快速检测方法是乳品中细菌总数快检中较为成型的方法，已经在欧美普遍推广，我国的台湾地区于1999前后引进并推广该技术。目前国际上比较有名的Celsis M4000 system是这个方面的先驱，但价格极为昂贵售价约为人民币50万左右，难于得到广泛应用和推广。南京农业大学周剑忠、董明盛发表的生物荧光技木在乳品工业中的应用及东北农业大学田波、霍贵成等发表的乳与乳制品中细菌总数的检测技术，分别属于国家科技攻关项目(2002BA518A12) 和“十五”重大攻关项目（2002 BA518A06）均把ATP荧光法细菌总数快速检测方法作为一个乳品中细菌总数快检的一个成型技术和发展方向加以介绍和推广。中西公司自主开发生产的ATP荧光法细菌总数快速检测已经达到了国外先进水平，并在东北农大教育部乳品重点实验室和国家食品质量监督检验中心进行了相关原料奶的相关技术性能验证实验，得到的结果是工作性能比较稳定，对周围环境要求低（电流、电压、噪声、温度等），体积小，易操作，工作流程简捷、清晰，操作结果可储存并以文件记录的方式查询，可与电脑连接实时检测并传输检测结果，可直接将检测数据转换成EXCEL文件，便于统计、汇总。经过对比在原料乳的检测中可有效排除原奶中的游离体细胞干扰，ATP检测结果与国标法检测结果基本相符合。二、乳品检测中应用的方向1. 在未经处理的原料乳质量控制中的应用用ATP生物荧光法对原奶中的细菌总数进行检测，可以便于乳品企业在收奶的过程中对原奶的品质做出快速判断，不合格的原奶当场拒收，合格的可根据检测结果对其进行分级。2.在巴氏杀菌奶质量控制中的应用制定货架期，控制巴氏杀菌后牛奶的二次污染对公众的健康有着重要意义。用ATP生物荧光法测得选择性培养牛奶中的ATP量后，就可预测巴氏杀菌奶的货架期，这种试验和最近欧洲委员会介绍的保证质量试验的结果一致。3.用于UHT奶和其他乳制品的无菌检测用平板计数法检测无菌UHT奶耗时长，等检测结果出来后，产品已经上市流通造成的影响也很难挽回。ATP荧光法细菌总数快检方法可以在产品出厂前就得到产品的卫生安全情况，而且这种方法对UHT巧克力奶特别有用。另外生物荧光检测也常被用来检测奶粉中的细菌总数。4.牛奶中抗生素或噬茵体残留的快速检测牛奶中的乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌，在含抗生素或被噬菌体污染的牛奶中乳酸菌的生长受到了抑制，其抑制程度与抗生素含量或噬菌体污染程度有关。通过乳酸菌在牛奶中生长时ATP变化的检测，可以很快检出牛奶中的抗生素或噬菌体的残留，在90 min内可检测到低于0.005 UmL的青霉素。5.在卫生监测方面