第11章-色谱分析基础课件.ppt
2023/4/3,一、色谱法的特点、分类和作用,1.概述 混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特（Tswett)在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种分离技术。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,2023/4/3,2.色谱法发展简史 色谱法早在1903年由俄国植物学家（Tsweett)分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。,色谱分析已从分离技术发展成为分离、分析技术的一门综合性学科。,2023/4/3,他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。,Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，称为吸咐色谱。,2023/4/3,叶片的石油醚萃取液 石油醚(流动相)叶绿素 色谱柱 叶绿素 叶黄素 碳酸钙颗粒（固定相）胡萝卜素 色谱图,当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,2023/4/3,他们还提出了色谱塔板理论；发明了液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。,R.L.M.Synge(1914-1994)the Nobel Prize in Chemistry(1952)for the invention of partition chromatography.,A.J.P.Martin(1910-2002),2023/4/3,1941年Martin和Synge把氨基酸的混合液注入到以硅胶作固定相的柱中，用氯仿作流动相，借助于氨基酸在硅胶中的水和有机溶剂氯仿两相中的溶解度不同而达到分离，故称为分配色谱。1944年Martin和Synge用滤纸代替硅胶,不用色谱柱，固定相是滤纸中含有水份的纤维素，流动相用有机溶剂，也成功地分离了氨基酸，从而创立了纸色谱法。1952年Martin等又提出以气体作流动相的气相色谱法。50年代又出现了将固定相涂布在玻璃板上的薄层色谱法。,2023/4/3,随后，1957年Golay开展了开管柱气相色谱。上个世纪六十年代末把高压泵和键合相固定相结合，出现了高效液相色谱。接着，出现了色谱法和其他检测技术的联用，例如GC-MS、GC-IR等。上个世纪八十年代，毛细管电泳出现，此后得到长足的发展，并不断出现新的模式。,2023/4/3,2023/4/3,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,2023/4/3,2.色谱法原理,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,2023/4/3,3.色谱法分类,3.1 按流动相的状态不同主要分为两类：（1）气相色谱（GC）：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）,2023/4/3,（2）液相色谱（LC）：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。,2023/4/3,（3）其他色谱方法,薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法,凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱:CO2流动相。高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。,2023/4/3,2023/4/3,3.色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。,2023/4/3,二、色谱分离过程,色谱分离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例：气固色谱和气液色谱，两者的分离机理不同。气固色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液色谱的固定相:由 担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：溶解与挥发的反复多次分配过程。,2023/4/3,气相色谱分离过程：,当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行；较难被吸附（溶解）的组分随载气较快地向前移动，较易被吸附（溶解）的组分则随载气较慢地移动。经过一定时间后，各组分就彼此分离。,2023/4/3,三、线性洗脱色谱流出曲线与术语,1.基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.色谱峰 当某组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线称为该组分的色谱峰。3.峰高(h)色谱峰顶到基线的垂直距离。,2023/4/3,色谱流出曲线：,2023/4/3,4.保留值 表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。,（1）时间表示的保留值 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值（即色谱峰顶值）时所需的时间。,调整保留时间（tR）：tR=tRt0,死时间（t0）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。,2023/4/3,（2）用体积表示的保留值,保留体积（VR）：VR=tRF0 F0为柱出口处的载气流量，单位：m L/min。死体积（V0）：V0=t0 F0 调整保留体积(VR)：V R=VR V0,2023/4/3,5.相对保留值r2，1,组分2与组分1调整保留值之比：r2，1=tR2/tR1=VR2/VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。所以又称为选择因子。,2023/4/3,6.区域宽度,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=4,2023/4/3,色谱流出曲线的意义：由色谱流出曲线可以实现以下目的：（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。（3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析。（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色谱柱的分离效能。,2023/4/3,第二节 色谱理论基础,一、塔板理论Plate theory二、速率理论Rate theory三、分离度Resolution,Fundamental of chromatograph theory,2023/4/3,一、塔板理论,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,（一）分配过程1.分配系数（partion factor）K,2023/4/3,分配系数 K 的讨论：,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；同一个组份在不同的固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。,2023/4/3,2.分配比（partion radio）k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。,分配比也称：容量因子(capacity factor)、容量比(capacity factor),2023/4/3,（1）容量因子与分配系数的关系,式中：为相比，即=Vm/Vs。填充柱相比：635；毛细管柱的相比：501500。容量因子越大，保留时间越长。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同:气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量。,2023/4/3,（2）分配比与保留时间的关系,某组分的k值可由实验测得，等于该组分的调整保留时间与死时间的比值：,（3）分配系数K及分配比k与选择因子r2,1的关系,如果两组分的K或k值相等，则r2,1=1，两组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,2023/4/3,基本保留方程可表示为：tR=t0(1+k)若载气流量F0恒定，也可用保留体积表示，则 VR=Vm+KVs 上式说明，色谱柱确定后，Vm和Vs即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。,（4）基本保留方程,2023/4/3,例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL的色谱柱分离A,B两个组分，它们的保留时间分别为14.4min，15.4min，不被保留组分的保留时间为4.2min，试计算：（1）各组分的容量因子（2）各组分的分配系数（3）AB两组分的选择因子rB,A,解：（1）kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43 kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67 K=k=kVm/VsKA=kAVm/Vs=2.431.26mL/0.148mL=20.7KB=kBVm/Vs=2.671.26mL/0.148mL=22.7(3)rB,A=KB/KA=22.7/20.7=1.10,2023/4/3,色谱理论：,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质,如分配系数）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论,2023/4/3,塔板理论的假设：在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度。(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。,（二）塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（plate theory）半经验理论，最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔。将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；在每一个塔板上，被分离组分达到一次分配平衡。,2023/4/3,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离（理论塔板高度）：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。,2023/4/3,2.有效塔板数和有效塔板高度,组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,2023/4/3,例：用一根柱长为1m的色谱柱分离含有A，B，C，D四个组分的混合物，它们的保留时间tR分别为6.4min,14.4min,15.4min,20.7min,其峰底宽Wb分别为0.45min,1.07min,1.16min,1.45min。试计算：各谱峰的理论塔板数。,解：,2023/4/3,3.塔板理论的特点和不足,（1）当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，即使分配系数只有微小的差别，仍可获得好的分离效果。所得色谱峰越窄。,（2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,（3）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,（4）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效（如塔板高度H）的因素及提高柱效的途径。,2023/4/3,二、速率理论-影响柱效的因素,1956年荷兰学者范弟姆特（Van Deemter)等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系。1.速率方程（也称范.弟姆特方程式）H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度;u：载气的线速度(cm/s),减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项常数各与哪些因素有关？,2023/4/3,A涡流扩散项：,A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，A项为零。,2023/4/3,B/u 分子扩散项,B=2 Dg：弯曲因子，空心毛细管,=1；填充柱色谱,1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;(4)扩散系数Dg与组分及载气的性质有关：Dg(M载气)-1/2；M载气，B值。Dg（M组分）-1（5）扩散系数Dg随柱温升高而增加。,2023/4/3,k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,C u 传质阻力项,传质阻力系数包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL系数，即：C=（Cg+CL）,2023/4/3,2.载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。,H-u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有零值点。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,2023/4/3,最佳流速uopt与最小理论塔板高度Hmin：,2023/4/3,3.速率理论的要点,（1）组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。,（2）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,（2）速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,（4）各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,2023/4/3,三、分离度,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：,2023/4/3,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：,柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离；K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，K较大,但分离的不好；K小，柱效低，分离效果更差。,2023/4/3,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%，有部分重叠；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和一半的比值。,2023/4/3,不同分离度时色谱峰分离的程度,2023/4/3,色谱基本分离方程式：令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：,2023/4/3,讨论：,（1）分离度与柱效的关系（柱效因子n)分离度与柱效因子n的平方根成正比，r2,1一定时，增加柱长以增加柱效n，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。增加n值得另一办法是减小柱的H值（2）分离度与选择因子r2,1的关系 增大r2,1是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r2,1增加一倍，需要的n有效 减小10000倍。增大r2,1的最有效方法是选择合适的固定相。,2023/4/3,例1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18 n有效=16R2 r21/(r21 1)2=161.52(1.18/0.18)2=1547（块）L有效=n有效H有效=15470.1=155 cm 即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,2023/4/3,例2：在3.0m色谱柱上，分离A、B组分，其保留时间分别为14.0min、17.0min，不被保留的组分的保留时间为1.0min，B 组分的峰底宽度Wb为1.0min。计算A和B达到基线分离时（R=1.5）的柱长为多少？,解：算出B组分的有效塔板数：再算出需要达到R=1.5时，需要的有效塔板数：,2023/4/3,由于nL，则要达到基线分离需要的柱长为：所以 L需=0.75m 因此要达到基线分离，所需柱长为0.75m。,
