第六章分离分析导论课件.ppt

一、概述,定义,分离分析法是一种利用试样中共存的组分间的吸附、分配、交换、迁移速率及其性能上的差异，先将其分离，而后通过检测器按一定顺序进行分析的一种方法。,色谱法的产生,色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3 有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响：,（1）一种是CaCO3 吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,一、概述,Tsweet的实验,一、概述,色谱法,混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。,流动相,气体 1952年产生气相色谱，是色谱法一项革命性进展。,液体 流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC发展，高压液相色谱。,一、概述,固定相：（1）固体吸附剂：CaCO3、Al 2O3等（2）液体固定相（载体+固定液高沸点有机化合物，涂在载体上）色谱分离法一定是先分离。后分析 一定具有两相；固定相和流动相 分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离,特点,（1）分离效能高（2）灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广,一、概述,我国情况,我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所卢佩章院士领衔首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。,二、色谱分析法分类,1、按两相状态分类气相色谱气体作流动相（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。,液相色谱液体作流动相（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相。（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。超临界液体色谱超临界流体作色谱流动相。,二、色谱分析法分类,2、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱固定相填充到柱管内 毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。,二、色谱分析法分类,（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。,二、色谱分析法分类,3、按分离原理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。,三、色谱图及常用术语,一、色谱图 混合物样品（A+B）色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线,三、色谱图及常用术语,二、色谱图中的基本术语,1、基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下，一条直线。基线上下波动称为噪音。,三、色谱图及常用术语,2、色谱峰的高度h（1）峰高h 色谱峰最高点与基线之间的距离，可用mm,mV，mA表示。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。,三、色谱图及常用术语,3.色谱峰的宽度标准偏差 峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。,峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离 Wb=4 半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度 W1/2=2.354 Wb=4 W1/2=0.589Wb,Wb,三、色谱图及常用术语,三、色谱图及常用术语,4.色谱峰面积A 色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰 A=1.065h W1/2 对于非对称的色谱峰 A=1.065h(W 0.15+W 0.85)/2,5.色谱保留值定性的依据,组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t 和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。,三、色谱图及常用术语,（1）死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。气相色谱惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。,三、色谱图及常用术语,(2)保留时间tR 组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。,二、原子吸收光谱仪,（3）调整保留时间tR扣除了死时间的保留时间。tR=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。tR体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,tR,三、色谱图及常用术语,保留值用体积表示：（4）死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。V0=t 0F0 柱后出口处流动相的体积流速mL/min,（5）保留体积VR 组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积 VR=t RF 0（6）调整保留体积VR扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。VR=tRF 0,V0、t0与被测组分无关，因而VR.tR更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,（7）相对保留值 2，1或i,s 在相同操作条件下，组分2或组分i对另一参比组分1或s调整保留值之比,三、色谱图及常用术语,三、分配平衡,在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。,1、分配系数 K(浓度分配系数),K随T变化，与固定相、流动相的体积无关,三、色谱图及常用术语,三、色谱图及常用术语,2、分配比k(又叫容量因子，容量比),k=,组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量=ms/mm=svs/mvm=K vs/vm,k随T、固定相、流动相的体积变化而变化k越大，组分在固定相中质量越多，tR越长K、k越大，组分在固定相中tR就越长,经推导得k与tR之间的关系：,三、色谱图及常用术语,k=tR/t0=(tR-t0)/t0 k=VR/V0=(VR-V0)/V0,总结,（1）色谱峰的位置即保留值进行定性分析。（2）色谱峰的h.A 进行定量分析。（3）色谱峰的位置及峰的宽度可评价色谱 柱效的高度。,四、色谱法的基本理论,一、塔板理论,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。,四、色谱法的基本理论,1、塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,四、色谱法的基本理论,对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每一个塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n 表示。n=L/H 或 H=L/n H越小，n越多，分离效果越好，用 H,n 评价柱效。由塔板理论导出n与Wb，W 1/2 的关系。*n=5.54(tR/W 1/2)2=16(tR/Wb)2,四、色谱法的基本理论,有时n 大，分离效果也不好，因用tR 内含tm，后来改用有效塔板数。,n 有效=5.54(tR/W 1/2)2=16(tR/Wb)2 H有效n 有效,n理=5.54(tR/W 1/2)2=16(tR/Wb)2 H理n 理,塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性。,四、色谱法的基本理论,、速率理论范第姆特方程,1956年，荷兰学者范第姆特VanDeomter）提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使 H 增大）影响的方程。此方程经简化后写为:,u为流动相线速度cm.s-1，线速度=柱长/死时间,该式称为速率方程（范氏方程）。下面我们将对公式中的各项进行讨论,四、色谱法的基本理论,（1）提出了影响的三项因素：涡流扩散项，分子扩散项，传质阻力项。（2）在流动相流速一定时，当、最小时，才小，n 才最高，柱效高。当、最大时，才大，n 才最小，柱效低。,四、色谱法的基本理论,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,A2dp A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关。减小：固定相颗粒应适当细小、均匀填充要均匀。,四、色谱法的基本理论,四、色谱法的基本理论,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,四、色谱法的基本理论,B2D 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。D为组分在流动相中扩散系数（c m2s-1）。Dg气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）,减小纵向扩散项u 采取措施：适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。适当降低柱温c.,四、色谱法的基本理论,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数包括两部分，m+Cs两项组成Cm 流动相传质阻力系数 组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,m,四、色谱法的基本理论,Cs 固定项传质阻力系数 即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,2,固定液膜厚度,组分在固定相中扩散系数,四、色谱法的基本理论,二、色谱基本分离方程,、分离度色谱柱的总分离效能指标 定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比,式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是 色谱分离的动力学因素。从中得到：两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分离越好。,四、色谱法的基本理论,两个峰tR 相差越大，W越窄，值越大，说明柱分离较能高。.5 两个组分能完全分开。.0 两组分能分开，满足分析要求。.0 两峰有部分重叠。,四、色谱法的基本理论,四、色谱法的基本理论,2、柱效能指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，来描述，n 越大，越小，柱效越高，对单个组分而言。对多个组分的分离来说，无法用n,H 来描述，n 大，小，几个峰未必分的开。,3、选择性描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示.r2,1越大，保留时间相差大，分离越好（但未考虑峰宽因素）,四、色谱法的基本理论,4、分离度与柱效能，选择性的关系,四、色谱法的基本理论,a:柱效项：塔板数决定，n 越大，柱效越高分离的越好。,b：选择性项：r2,1越大，tR（）与tR（1）相差越大，分的越好。,C：柱容量项：k大一些对分析有利;太大，tR长，柱容量合适,分的才好。一般k,四、色谱法的基本理论,以n有效表示，则有：,四、色谱法的定性定量分析,一、定性分析 定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性 在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。,四、色谱法的定性定量分析,（2）利用峰高增量定性,若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性 通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值,四、色谱法的定性定量分析,2.与其它分析仪器联用的定性方法,四、色谱法的定性定量分析,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,二、定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,mi=fi Ai mi=fihi mi被测组分i的质量，fi比例系数Ai、hi被测组分的峰面积及峰高,A=1.065hW12 A=1.065h（W0.15W0.85）/2,四、色谱法的定性定量分析,四、色谱法的定性定量分析,1、定量校正因子,色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即不同物质检测器的灵敏度不同，相同的峰面积并不意味着有相等的量。定量校正因子：单位峰面积对应组分的质量。fi=mi/Ai fi绝对校正因子,(1)绝对校正因子 绝对校正因子受操作条件影响较大，要严格控制色谱条件，不易准确测定，没有统一标准，无法直接引用，定量分析中采用相对较正因子。,四、色谱法的定性定量分析,（2）相对校正因子,用一个标准，把所有组分的A较正到标准物的A上，在同一标准上进行比较计算，热导检测器常用苯作标准。相对定量校正因子fi定义：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。,fi(m)表示相对质量校正因子,四、色谱法的定性定量分析,也可用相对摩尔校正因子fi(M),凡文献查得的校正因子都是指相对校正因子，可用fM,fm分别表示摩尔校正因子和质量校正因子,四、色谱法的定性定量分析,2、定量方法,（1）归一化法 试样各组分都出峰，可用归一化法定量。把所有出峰组分的含量之和当作100%的定量分析方法称为归一化法。若样品中有几个组分，每个组分的量分解为m1 m2mn 各组分含量总和为m，则组分的质量为mi,质量分数Wi为,四、色谱法的定性定量分析,优点：简便、准确、不需标准物，不必准确称量和准确进样，操作条件稍有变化对结果影响较少。缺点：所有组分都出峰，并测所有组分的A和fi,四、色谱法的定性定量分析,（2）内标法,准称样品m（含mi被测组分）+准称纯物质作内标物ms,混合物,进样,四、色谱法的定性定量分析,四、色谱法的定性定量分析,（3）外标法标准曲线法,当样品中各组分不能完全流出，又没有合适内标时，可采用此法。将待测组分的纯物质配制不同浓度的标准系列，在相同操作条件下，定量进样，测各个峰的A或h，绘制AC曲线或h C曲线。,四、色谱法的定性定量分析,在完全相同条件下，测待测样品，根据A待或h待，从曲线上查出待测组分含量。优点：操作简单，计算方便，不用fi。缺点：要求准确进样，操作条件稳定。,A(h),A待,C待,C,