第七章-外源性化学物致突变作用第一次课件.ppt

第 七 章 外源化学物致突变作用Chapter 7 Mutagenesis of Xenobiotics,公共卫生与管理学院卫生毒理学教研室房蕾07012,一般毒性作用特殊毒性作用三致作用 致畸、致突变、致癌,公共卫生学院 房蕾 2,现实生活中.,自然界中的自发突变转基因的动植物（红薯、蓝玫瑰等）各种有害因素引起的突变（化学、物理、生物）外源化学物致突变作用-体细胞突变-癌,公共卫生学院 房蕾 3,公共卫生学院 房蕾 4,公共卫生学院 房蕾 5,主要内容,第一节 概述第二节 外源化学物致突变的类型第三节 外源化学物致突变的作用机制及后果第四节 机体对致突变作用的影响第五节 观察外源化学物致突变作用基本方法,公共卫生学院 房蕾 6,目的要求：,掌握：外源化学物致突变作用概念、类型及后果；几种主要致突变试验原理。熟悉：外源化学物致突变作用的机制；观察外源化学物致突变作用的常用方法及评价。了解：外源化学物致突变作用的遗传学基础；机体对致突变作用的影响。,公共卫生学院 房蕾 7,第一节 概述：,一、遗传与变异（inheritance and variation）遗 传：生物物种通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续。变 异：在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异。遗传和变异是生物最基本的特征。,遗传是保持生物种族特性的根本。遗传的稳定是相对的，一方面生物的遗传物质在自我复制过程中有可能发生改变；另一方面生物个体发育在受到复杂变化的内外环境条件 影响下，性状的发育可能有所不同。,造成生物变异的原因有：亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。,公共卫生学院 房蕾 8,二、突变与致突变作用、致突变物,（一）突变（mutation）：遗传结构本身的变化及其引起的变异。生物体的遗传物质发生了根本的、突然的变化，这种变化起源于基因和染色体，因此是可遗传的变异。1901 年荷兰学者德弗里斯在首次提出突变.,摩尔根果蝇杂交实验1909年，摩尔根发现红眼果蝇中有白眼果蝇。他因为发现果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在每条染色体内是直线排列及连锁和交换定律，于1933年，摩尔根获得诺贝尔生理医学奖。1946年，摩尔根的学生米勒，证明X射线能使果蝇的突变率提高150倍，因而成为诺贝尔奖获得者。,公共卫生学院 房蕾 9,突变研究简史,公共卫生学院 房蕾 11,突变从发生原因上，可分为：,1、自发突变(spontaneous mutation)：由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。,特点：发生的方式是渐进的过程，且频率很低，物种进化与自发突变密切相关,它提供了生物进化的基础。,2、诱发突变(induced mutation)：指人为地造成突变。特点：发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。,公共卫生学院 房蕾 12,有益的突变：花-蓝色妖姬，杂交水稻，植物的抗病性突变、耐旱性突变等。三倍无籽西瓜,有害的突变：物理因素（如X射线）化学因素（如亚硝酸盐）绝大多数的人类遗传病，植物中常见的白化苗。,公共卫生学院 房蕾 13,（二）致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。突变的发生及其过程即为致突变作用。致突变性（mutagenicity）：化学物引起遗传物质发生突变的能力。,公共卫生学院 房蕾 14,（三）致突变物（mutagen）：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环 境因子，又称诱变剂。1、直接致突变物（direct-acting mutagen）2、间接致突变物（indirect-acting mutagen）或前诱变物(promutagen),公共卫生学院 房蕾 15,（四）遗传毒物和遗传毒性,1、遗传毒物(genotoxic agent or genotoxicant)：由于致突变物对生物体的起始作用点是遗传物质，故也称为遗传毒物。2、遗传毒性(genetic toxicity or genotoxicity)：指遗传毒物引起生物细胞基因组分子结构特异改变的有害效应，也称为基因毒性。,三、遗传学基础（了解）,1DNA与基因（1）基因（gene）：是DNA分子中最小的完整功能单位。（2）基因组（genosome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质。,公共卫生学院 房蕾 16,2染色质与染色体在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质（chromatin）。它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体（Chromosome）。（提问：故染色质与染色体是由相同物质组成的吗？）,公共卫生学院 房蕾 17,3体细胞和生殖细胞体细胞就是指普通的细胞 生殖细胞专指精细胞，卵细胞，精原细胞，卵原细胞等 体细胞不可以进行减数分裂，而可进行有丝分裂；而生殖细胞可以进行减数分裂，不可以进行有丝分裂体细胞的染色体数目是生殖细胞的一倍,公共卫生学院 房蕾 18,4基因型与表型基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。,公共卫生学院 房蕾 19,5细胞周期、有丝分裂与减数分裂,公共卫生学院 房蕾 20,公共卫生学院 房蕾 21,第二节 外源化学物致突变的类型,公共卫生学院 房蕾 22,从遗传学角度可分为：,（根据遗传物质受损伤的程度）一、基因突变（光镜下观察不到，通过表型改变判断）二、染色体结构畸变三、染色体数目异常,可用光学显微镜观察,公共卫生学院 房蕾 23,从机理角度可分为：,以DNA为靶的损伤（基因突变和染色体结构畸变）不以DNA为靶的损伤（染色体数目异常）,公共卫生学院 房蕾 24,一、基因突变,基因突变（genetic mutation)：是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变，由于基因突变限制在某一特定部位，故又称为点突变（point mutation）。,公共卫生学院 房蕾 25,根据基因结构的改变分类：（一）碱基置换（二）移码突变（三）大段损伤,公共卫生学院 房蕾 26,（一）碱基置换（base substitution）,1概念：碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变。,2类型：转换（transition）：嘌呤换嘌呤；嘧啶换嘧啶。颠换（transversion）：嘌呤嘧啶互换。,A=T,GCA，腺嘌呤；T，胸腺嘧啶；G，鸟嘌呤；C，胞嘧啶,TTA GCG TAC GCA TAG AAT CGC ATG CGT ATC,TTA ACG TAC CGA TAG AAT CGC ATG CGT ATC,第一次复制,TTA GCG TCC GCA TAG AAT CGC ATG CGT ATC,TTA ACG TAC CGA TAG AAT TGC ATG CGT ATC,TTA GCG TCC GCA TAG AAT CGC AGG CGT ATC,第二次 复制,错误配对,转换,颠换,碱基置换,错误配对,腺嘌呤A 鸟嘌呤G 胞嘧啶C 胸腺嘧啶T,第一次复制,第二次 复制,公共卫生学院 房蕾 28,公共卫生学院 房蕾 29,碱基置换的结果：,（1）同义突变(missense mutation）：未引起基因产物氨基酸序列的改变。如苏氨酸：ACU ACC ACA ACG。（遗传密码子具有兼并性）,公共卫生学院 房蕾 30,遗传密码表,DNA AGC AGT AGA AGG 转录mRNA UCG UCA UCU UCC 翻译蛋白质 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸,31,公共卫生学院 房蕾 32,碱基置换的结果：,（2）错义突变（synonymous mutation）：引起了产物氨基酸序列的改变。致死突变：必需氨基酸渗漏突变：部分活性中性突变：无影响,DNA ACG ATG AAG 转录 mRNA UGC UAC UUC 翻译 蛋白质 半胱氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸,33,公共卫生学院 房蕾 34,碱基置换的结果：,（3）无义突变(nonsense mutation)：指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变。终止密码:UAG,UAA,UGA是终止密码子。链终止突变延长突变,DNA ACC ACT ATG ATT 转录mRNA UGG UGA UAC UAA 翻译蛋白质 色氨酸 翻译终止 酪氨酸 翻译终止,35,公共卫生学院 房蕾 36,酪氨酸,公共卫生学院 房蕾 37,（二）移码突变（frameshift mutation）,指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基的减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸。,公共卫生学院 房蕾 38,移码突变示意图,C A T C A T C T C A T C A T C A T C A T,组 组 组 组 组 组 组,A,公共卫生学院 房蕾 39,（三）大段损伤（large fragment damge）,指DNA序列上有较长的一段序列的重排分布，包括大段（一个碱基至数千个碱基）的插入、缺失、取代、复制和倒位，又称片段突变。,公共卫生学院 房蕾 40,据突变效应方向基因突变可分为,正向突变：是指改变了野生型性状的突变。回复突变：是指突变体所失去的野生型性状可以通过第二次突变恢复。,公共卫生学院 房蕾 41,突变从遗传学角度可分为：,一、基因突变的类型 二、染色体结构畸变 三、染色体数目异常,公共卫生学院 房蕾 42,二、染色体结构畸变（chromosome aberration）,（一）概念：由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现染色体结构异常称为染色体畸变或染色体结构畸变。是遗传物质较大的改变。染色体型畸变/染色单体型畸变染色体断裂剂,公共卫生学院 房蕾 43,（二）染色体结构异常的类型：1、缺失2、重复3、倒位4、易位,公共卫生学院 房蕾 44,1无着丝粒断片和缺失（deletion）,断片,公共卫生学院 房蕾 45,微核和微小体,微核：无着丝粒断片，在下一 次细胞分裂时因无着丝粒，不能进入分裂的核中滞留在细胞质中。微小体：断片很小，小于染色单体宽度。,公共卫生学院 房蕾 46,人类第5染色体短臂缺失杂合个体猫叫综合症,公共卫生学院 房蕾 47,2重复（duplication）：重复是指染色体的片段出现多个拷贝。,公共卫生学院 房蕾 48,3 倒位（inversion）：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180度再重接，称为倒位。,公共卫生学院 房蕾 49,倒位的类型与形成,公共卫生学院 房蕾 50,4易位（translocation）：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。（1）相互易位（2）简单易位,公共卫生学院 房蕾 51,易位类型及形成,正常染色体1,正常染色体2,相互易位,简单易位,公共卫生学院 房蕾 52,突变从遗传学角度可分为：,一、基因突变 二、染色体结构畸变 三、染色体数目异常,公共卫生学院 房蕾 53,三、染色体数目异常,染色体数目异常可能表现为（一）整倍性畸变：可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。（二）非整倍性畸变：比二倍体多或少一条或多条染色体。,公共卫生学院 房蕾 54,配子：单倍体（n，22+X或22+Y）体细胞：二倍体（2n，44+XX或44+XY）染色体数目异常可能表现为多倍体和非整倍体。,55,（一）多倍体超过二倍体的整倍性畸变统称为多倍体。三倍体或四倍体。,1、三倍体,69，XXX69，XXY69，XYY三倍体/二倍体嵌合体,57,双雄受精（1-3）和双雌受精（4-5）,58,2、四倍体,全身为4n的个体及4n/2n嵌合体均罕见；4n和多n细胞在一些肿瘤组织和培养细胞中较常见。四倍体形成的机制核内复制：染色体复制二次核内有丝分裂,59,（二）非整倍体比二倍体多或少一条或多条染色体。亚二倍体：单体超二倍体：三体最常见,60,45，X女性性腺发育不全（Turner综合征）常见，极少数可存活，但多在胚胎期流产。常染色体单体难以存活。,61,颅面畸形，2/3患儿有上唇裂，常有腭裂，常见多指（趾），手指相盖叠等。,18-三体，即Edwards综合征,非整倍体形成机制1、染色体不分离减数分裂不分离有丝分裂不分离2、染色体丢失,63,64,受精,减数分裂I不分离,减数分裂II不分离,初级不分离,第一次卵裂不分离,65,有丝分裂不分离,第二次卵裂不分离,47,45,46,染色体丢失（chromosome loss)细胞分裂过程中个别染色体没有进入子细胞核。,66,45,公共卫生学院 房蕾 67,第三节外源化学物致突变作用 的机制及后果,公共卫生学院 房蕾 68,致突变模式：DNA损伤-修复-突变模式,物理因素化学因素生物因素,69,致突变作用的因素,1、物理因素,电离辐射非电离辐射,70,射线,环境污染职业接触食品污染农药等,71,2、化学因素,病毒细菌生物毒素,72,3、生物因素,公共卫生学院 房蕾 73,一、引起突变的DNA变化（基因突变、染色体畸变）二、引起突变的细胞分裂过程改变（染色体数目的改变）三、其他的改变,外源化学物致突变作用的机制,公共卫生学院 房蕾 74,一、引起突变的DNA变化,（一）碱基损伤：1、碱基错配 2、平面大分子嵌入DNA链3、碱基类似物（base analogue）的取代4、碱基的化学结构改变或破坏（二）DNA链受损:1、二聚体的形成 2、加合物（adduct）的形成3、DNA蛋白质交联,公共卫生学院 房蕾 75,（一）碱基损伤：,1、碱基错配:烷化剂(alkylating agent)：对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质。烷化作用：烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合的过程。烷化位点:鸟嘌呤的N7位，其次是O6位 腺嘌呤的N1、N3和N7也易烷化,公共卫生学院 房蕾 76,1、碱基错配:,公共卫生学院 房蕾 77,2、平面大分子嵌入DNA链,嵌入剂,以静电吸附形式嵌入DNA相邻碱基之间，引起移码突变,78,公共卫生学院 房蕾 79,3、碱基类似物取代,有些化学物结构与碱基非常相似，称为碱基类似物。例如：5溴脱氧尿嘧啶核苷（5-BU）-胸腺嘧啶 2氨基嘌呤（2-AP）-鸟嘌呤,Br,5-BU引起的DNA碱基对的改变5-溴尿嘧啶(5-BU)是T的类似物。5-BU有两种互变异构体：酮式、烯醇式。酮式可与A互补配对，烯醇式可与G互补配对。,80,公共卫生学院 房蕾 81,4、碱基的化学结构改变或破坏,（1）对碱基产生氧化作用，破坏或改变碱基结构。（2）在体内形成过氧化物或自由基来破坏嘌呤碱。,亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。,甲醛、氧基甲酸乙酯等,导致DNA链的断裂,公共卫生学院 房蕾 82,（二）DNA链受损,1、二聚体的形成 2、加合物（adduct）的形成3、DNA-蛋白质交联,公共卫生学院 房蕾 83,1、二聚体的形成（阻止DNA复制，引起细胞死亡）,公共卫生学院 房蕾 84,2、加合物（adduct）的形成,许多化学诱变剂或其活化产物是亲电子物，可与细胞内DNA，RNA和蛋白质等大分子亲核物质发生共价结合，形成稳定复合物，很难用一般的化学或生物学方法使其解离。代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类（亲电子物）。后 果：DNA立体构象发生变化，阻断受损部位DNA半保留复制和转录。,公共卫生学院 房蕾 85,3、DNA-蛋白质交联物形成,DNA-DNA交联：如苯并（a）芘，砷化合物，醛类化合物（甲醛等）等。DNA-蛋白质交联：如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气、各种铂的衍生物。,公共卫生学院 房蕾 86,二、引起突变的细胞分裂过程改变,非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常而产生，主要涉及细胞分裂过程的改变。,如纺锤体，微管蛋白的合成与聚合，微管结合蛋白合成与功能发挥，细胞分裂纺锤纤维的功能发挥，着丝粒与之有关的蛋白质作用，极体复制与分离，减数分裂时同源染色体联合配对和重组等。,公共卫生学院 房蕾 87,非整倍体细胞产生原因：,1、不分离：（1）同源染色体减数分裂I期不能适当分离，（2）姐妹染色体在减数分裂期，或有丝分裂期不能适当分离。结果：纺锤体一极接受了同源或两个染色单体，而另一极则没有。,公共卫生学院 房蕾 88,2、染色体丢失（chromosome loss)：细胞分裂过程中个别染色体没有进入子细胞核。3、联会复合体形成障碍和第一次减数分裂时着丝粒早熟分离而产生非整倍性。,公共卫生学院 房蕾 89,引起整倍体的原因,核内复制（endoreduplication）：（1）第一次有丝分裂：染色体及着丝粒正常复制，但纺缍体形成受到障碍，全部姊妹染色单体不能分开，细胞也不能进行分裂，形成间期四倍体细胞核。（2）第二次有丝分裂：恢复正常的复制和分开，中期便可见每四条染色单体整齐排列的现象。,公共卫生学院 房蕾 90,非整倍体与多倍体产生机制,主要是有关纺锤体的：1、与微管蛋白二聚体结合2、与微管上的巯基结合3、破坏已组装的微管4、妨碍中心粒移动5、其它作用,公共卫生学院 房蕾 91,三、其他的改变,对DNA合成和修复有关的酶系统的作用（一）DNA复制的高保真性（二）修复,公共卫生学院 房蕾 92,突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞 体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代。生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代。,公共卫生学院 房蕾 93,公共卫生学院 房蕾 94,（一）生殖细胞突变的后果,1致死性突变：显性致死：突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应。,公共卫生学院 房蕾 95,2非致死性突变（可遗传的改变）显性遗传：下一代遗传病发病率增加。隐性遗传：增加下一代基因库的遗传负荷（genetic load）。,致死性突变引起死胎，影响后代数量而非质量；非致死性突变主要影响后代质量。,公共卫生学院 房蕾 96,基因库：指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。遗传负荷（genetic load)：指一种物种的群体中每一个个体携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。,公共卫生学院 房蕾 97,（二）体细胞突变的后果,1癌变：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变。致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎。其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老。,公共卫生学院 房蕾 98,小结,第一节 概述第二节 化学毒物致突变的类型第三节 化学毒物致突变的作用机制及后果,公共卫生学院 房蕾 99,练习题,1DNA链中减少了一对碱基可导致 A染色体畸变B移码突变 C碱基置换 D大段损伤,公共卫生学院 房蕾 100,关于倒位的描述正确的是 A染色体上的基因有丢失 B染色体只发生一次断裂 C染色体两臂均断裂断片互换 D染色体片断旋转180度,公共卫生学院 房蕾 101,3.化学毒物引起突变类型不包括：A基因突变 B癌变 C染色体畸变 D染色体数目异常,公共卫生学院 房蕾 102,4.下列哪种类型不属于以DNA为靶的诱变 A烷化剂作用 B碱基类似物取代作用 C嵌入剂作用 D对DNA合成酶系的破坏作用,练习题：,1、突变、致突变作用的概念；,公共卫生学院 房蕾 103,公共卫生学院 房蕾 104,第四节 机体对致突变作用的影响,公共卫生学院 房蕾 105,DNA高保真复制机体修复机制致突变机制模式 损伤-修复-突变DNA损伤发生后，细胞对DNA损伤的反应首先是识别损伤，启动多种修复机制。,公共卫生学院 房蕾 106,损伤修复的基本机制损伤识别损伤去除修复性DNA合成DNA连接,公共卫生学院 房蕾 107,机体修复DNA损伤的机制可分为两大类:损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。修复机制：对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有状态。,公共卫生学院 房蕾 109,针对紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体的修复机制,一、DNA损伤的修复,1光复活,依赖光，酶切嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原结构上,光裂合酶(photolyase)，广泛存在于原核生物和真核生物体内,公共卫生学院 房蕾 111,鸟嘌呤O6位被烷化，易造成碱基错配 烷基转移酶将鸟嘌呤O6位甲基转给蛋白质，使其恢复正常的碱基配对特性 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶,2“适应性”反应,公共卫生学院 房蕾 112,负责较大范围损伤的修复机制，多步骤修复过程，存在于真核生物,3切除修复,切除核苷酸修复 切除碱基修复 误配修复,（二）碱基切除修复,DNA糖基酶识别并切除损伤碱基无碱基核酸内切酶将DNA链切断，去除损伤碱基，留下AP基因座由聚合酶和连接酶完成修复是较大范围损伤的修复机制碱基氧化损伤的主要防御系统，也可修复碱基错配、烷化等,113,（三）核苷酸切除修复,可修复多种类型的DNA损伤，特别是较大的DNA损伤，及他机制不能去除的DNA加合物等。基本步骤：损伤识别；切开（内切酶）；去除寡聚核苷酸（外切酶）；DNA合成（聚合酶）；连接（连接酶）。转录基因的DNA损伤较基因组的其他DNA损伤优先得到修复，保证了转录过程的完整性。,114,公共卫生学院 房蕾 116,二、遗传因素对致突变作用的影响,（一）代谢酶遗传多态性 有些人易受致突变作用，是因为其体内代谢酶与大多数人不同，可增强代谢活化或抑制代谢灭活。（二）修复功能的个体差异 修复过程由不同功能的酶参与，修复酶存在多态性表现出明显的个体差异。,公共卫生学院 房蕾 117,特异性修复酶,1O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT),(二)修复功能的个体差异,将嘌呤与胸嘧啶上的烷基转移到自身胱氨酸的残基上,有明显的组织差异和个体差异,公共卫生学院 房蕾 118,DNA断裂修复酶，可能是氧化损伤的一种重要修复形式 通过其催化的反应产生多种生物学效应，如诱导细胞NAD消耗；抗重组和基因稳定的作用；核酶修饰作用；组蛋白结合及对染色体构型的影响；参与细胞凋亡,2聚(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶(PARP),公共卫生学院 房蕾 119,第五节 观察外源化学物致突变作用基本方法,公共卫生学院 房蕾 120,一、观察项目的选择,（一）观察效应终点的类型 将致突变试验的观察终点称为遗传学终点(genetic endpoint)。已有致突变试验能反映的遗传学终点:1.基因突变 2.染色体畸变 3.染色体组畸变 4.DNA原始损伤,公共卫生学院 房蕾 121,（二）试验组合原则,一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。2.试验组中的指示生物应包括几个进化程度不同的物种，如原核细胞、低等和高等真核细胞，至少包括原核细胞与真核细胞两个系统。3.试验组应包括体内试验与体外试验。4.应包括生殖细胞和体细胞。,公共卫生学院 房蕾 122,二、常用的致突变试验,（一）细菌回复突变试验（Ames试验）:利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性。常用菌株：鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌。鼠伤寒沙门菌突变试验是应用最广泛的检测基因突变的方法，常称Ames试验。,公共卫生学院 房蕾 123,Ames试验原理：,检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株（his-）回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。,公共卫生学院 房蕾 124,鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株。(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,公共卫生学院 房蕾 125,公共卫生学院 房蕾 126,(二)微核试验(Micronucleus test，MNT),微核(micronucleus):是指染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在子细胞的细胞质中，形成一个或几个规则的次核，称微核。微核试验(Micronucleus test，MNT)：是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出：DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。,公共卫生学院 房蕾 127,传统的微核试验是体内试验。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（PCE）作微核试验。,公共卫生学院 房蕾 128,目前对微核试验已有较大的改进:(1)体外微核试验，常用细胞有中国仓鼠肺细胞(CHL），中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及中国仓鼠成纤维细胞(V79)等，体外试验比体内试验易于操作和控制受试物浓度。(2)周围血微核试验，使其有可能成为在人群中观察化学毒物遗传毒性的一种手段，进行人群流行病学调查。(3)双核细胞法，以提高微核的灵敏度。,公共卫生学院 房蕾 129,公共卫生学院 房蕾 130,MN,NCE,公共卫生学院 房蕾 131,（三）单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE),在单细胞水平上定量检测DNA损伤（DNA完整性）原理：在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核移出的DNA断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故又称彗星试验（comet test）。,公共卫生学院 房蕾 132,公共卫生学院 房蕾 133,(四)其他方法：,染色体畸变分析：观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。2.姐妹染色单体交换试验（SCE）：3.果蝇伴性隐性致死试验(sex-linked recessive lethal test，SLRL）4.显性致死试验(dominant lethal test)5.程序外DNA合成试验（UDS试验）,公共卫生学院 房蕾 134,(1)转基因小鼠致突变检测系统,（五）观察方法的新进展：,利用穿梭载体于原核和真核间往返转移，带可回收靶基因载体的转基因小鼠提供哺乳动物体内基因的检测系统，用以测定自发和诱发突变率，分析基因突变的组织专一性和顺序变化，阐明DNA修复、基因毒性、突变和癌变的分子机制,公共卫生学院 房蕾 135,转基因动物是指基因组中整合了以实验方法导入的稳定的外源DNA，并能遗传给后代的一类动物。转基因小鼠模型：Big Blue Mouse 和Muta Mouse优点：根据目的导入基因；敏感性高；结果可靠（完整的生物体系）。,公共卫生学院 房蕾 136,(2)微核自动化检测技术,主要使用流式细胞仪和图像分析系统两种仪器。流式细胞仪具有测定精确，定量参数多，检测速度快的特点,公共卫生学院 房蕾 137,(3)荧光原位杂交技术,(fluorescence in situ hybridization，FISH),将荧光标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的,公共卫生学院 房蕾 138,应用,对染色体精细结构的分析；对非整倍体的检测,体细胞或生殖细胞；分裂细胞或间期细胞，都能检出染色体断裂剂、非整倍体诱发剂，并可检出染色体精细结构改变,公共卫生学院 房蕾 139,三、致突变试验中的一些问题,（一）阴性对照和阳性对照的设立：目的：证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实本实验的重复性（二）体外试验活化系统的采用：S9是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统。,公共卫生学院 房蕾 140,(二)体外试验的活化系统,1哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。2S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。,公共卫生学院 房蕾 141,3纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。,(二)体外试验的活化系统,公共卫生学院 房蕾 142,（三）致突变试验与致癌试验的关系,1、已知大多数化学致癌物具有致突变作用（致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实）。2、发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。3、传统的长期致癌试验，花费大，周期长，需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。,公共卫生学院 房蕾 143,致突变试验举例,美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。,公共卫生学院 房蕾 144,致突变试验举例,国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为细菌基因突变试验；体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测)。,公共卫生学院 房蕾 145,致突变试验举例,我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(1994)中对遗传毒理学试验的要求是：根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验 以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。,公共卫生学院 房蕾 146,习 题,【名词解释】1.致突变作用【简答题】1.简述外源化学物致突变的类型 2.简述 Ames 试验的原理,公共卫生学院 房蕾 147,谢谢！,公共卫生学院 房蕾 148,THANKS！,公共卫生学院 房蕾 149,成为带正电荷的季铵基团，产生两个效应：1、促进第一位氨基上氢的解离，使G与T配对，造成G:C-A:T转换。2、减弱了N9位上的N-糖苷键，产生去嘌呤作用，从而可能在无碱基位置上插入任何一个碱基。,鸟嘌呤上N7位烷基化:,公共卫生学院 房蕾 150,AP位点（apurinic or apyrimidinic site)：指丢失碱基的DNA留下一个无嘌呤 或无嘧啶的位点.,公共卫生学院 房蕾 151,1、光修复 由于紫外线的作用，DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，在DNA螺旋形成一个巨大的凸起或扭曲，好象一个“赘瘤”，这个赘瘤被一种特殊的巡回酶(例如光激活酶)所辨认，在有兰色光波的条件下，二聚体被切开，DNA恢复正常。(,公共卫生学院 房蕾 152,3、重组修复 修复的主要步骤如下：(1)、含胸腺嘧啶二聚体DNA复制，使子DNA链在损伤部位出现缺口。(2)、完整的母链有有缺口的子链重组，缺口在DNA聚合酶的作用下，以对侧子链为模板由母链合成的DNA片段弥补。(3)、在连接酶作用下以磷酸二酯键连接新旧链而完成修复。(动画1114),公共卫生学院 房蕾 153,从分子水平上分析，突变主要有两种，一是分子结构的改变，如碱基替换(动画1108)和倒位(动画1109)，二是移码，如碱基的缺失(动画1110)和插入(动画1111)。,公共卫生学院 房蕾 154,镰刀型细胞贫血症病因的图解,