酵母基因工程培训课程课件.ppt

第十五章 酵母基因工程,五、酵母菌的表达系统,第十五章 酵母基因工程,三、酵母菌的载体系统,二、酵母菌的宿主系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,四、酵母菌的转化系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的分类学特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,2、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的,基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章 酵母基因工程,二、酵母菌的宿主系统,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,第十五章 酵母基因工程,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）,毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶,ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平,ose1 提高重组蛋白表达 转录水平,ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,（1）泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能,UBI 4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA 1缺陷型：,UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4-ubc5 双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,2,酵母菌中的野生型质粒,1,第十五章 酵母基因工程,1.酵母菌中的野生型质粒,（1）酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒，拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列，600 bp，重组,FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性,STB REP的结合位点,接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质,粒类似。,1.酵母菌中的野生型质粒,（2）乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基,的双链线状质粒pGKL1和pGKL1,拷贝数为50-100个，分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。,2.酵母菌克隆表达质粒的构建,（1）含有ARS的YRp质粒的构建,ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb,就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代,以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,2.酵母菌克隆表达质粒的构建,（2）含有CEN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个,（3）含有TEL的YAC质粒的构建,2.酵母菌克隆表达质粒的构建,（4）含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，,构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定,序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域,四、酵母菌的转化系统,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,1、酵母菌的转化程序,3、用于转化子筛选的标记基因,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的转化程序,（1）酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。,但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%,1、酵母菌的转化程序,（2）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克,处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1、酵母菌的转化程序,（3）酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，,但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广，而且转化率可高达105/mg DNA。,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总,数的50-80%,3、用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和,显性基因两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,3、用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph 氨基糖苷转移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,五、酵母菌的表达系统,2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,1、酵母菌启动子的可控性,3、酵母菌表达系统的选择,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌启动子的可控性,pho4TS-PHO5启动子：,酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭,23诱导表达,（1）温度控制型启动子,PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活,1、酵母菌启动子的可控性,a a 型启动子：,酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型,温度控制型启动子,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,a2,a1,25,35,1、酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,（2）超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因编码,2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,外源基因稳态mRNA的浓度,外源基因mRNA的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%,以上的氨基酸是由25个密码子编码的,3、酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢,（1)酿酒酵母表达系统,酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,3、酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也,(2)乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优,于酿酒酵母表达系统。,3、酵母菌表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生,(3)巴斯德毕赤酵母表达系统,长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长,迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,3、酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被,(4)多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒,能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,第十五章 酵母基因工程,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,2、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要,结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22,病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,2、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括,将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活,性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平,均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中,的病毒颗粒相同。,目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化,重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。,进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作,用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗,原缺乏响应的人群的免疫反应。,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的转化子,重组分子,转化his-的受体细胞,染色体DNA,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,重组巴斯德毕赤酵母的性能,由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因,AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲,醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%,在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐,中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝,疫苗。,1、不是井里没有水，而是你挖的不够深。不是成功来得慢，而是你努力的不够多。2、孤单一人的时间使自己变得优秀，给来的人一个惊喜，也给自己一个好的交代。3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!5、心情就像衣服，脏了就拿去洗洗，晒晒，阳光自然就会蔓延开来。阳光那么好，何必自寻烦恼，过好每一个当下，一万个美丽的未来抵不过一个温暖的现在。6、无论你正遭遇着什么，你都要从落魄中站起来重振旗鼓，要继续保持热忱，要继续保持微笑，就像从未受伤过一样。7、生命的美丽，永远展现在她的进取之中;就像大树的美丽，是展现在它负势向上高耸入云的蓬勃生机中;像雄鹰的美丽，是展现在它搏风击雨如苍天之魂的翱翔中;像江河的美丽，是展现在它波涛汹涌一泻千里的奔流中。8、有些事，不可避免地发生，阴晴圆缺皆有规律，我们只能坦然地接受;有些事，只要你愿意努力，矢志不渝地付出，就能慢慢改变它的轨迹。9、与其埋怨世界，不如改变自己。管好自己的心，做好自己的事，比什么都强。人生无完美，曲折亦风景。别把失去看得过重，放弃是另一种拥有;不要经常艳羡他人，人做到了，心悟到了，相信属于你的风景就在下一个拐弯处。10、有些事想开了，你就会明白，在世上，你就是你，你痛痛你自己，你累累你自己，就算有人同情你，那又怎样，最后收拾残局的还是要靠你自己。11、人生的某些障碍，你是逃不掉的。与其费尽周折绕过去，不如勇敢地攀登，或许这会铸就你人生的高点。12、有些压力总是得自己扛过去，说出来就成了充满负能量的抱怨。寻求安慰也无济于事，还徒增了别人的烦恼。13、认识到我们的所见所闻都是假象，认识到此生都是虚幻，我们才能真正认识到佛法的真相。钱多了会压死你，你承受得了吗?带，带不走，放，放不下。时时刻刻发悲心，饶益众生为他人。14、梦想总是跑在我的前面。努力追寻它们，为了那一瞬间的同步，这就是动人的生命奇迹。15、懒惰不会让你一下子跌倒，但会在不知不觉中减少你的收获;勤奋也不会让你一夜成功，但会在不知不觉中积累你的成果。人生需要挑战，更需要坚持和勤奋!16、人生在世：可以缺钱，但不能缺德;可以失言，但不能失信;可以倒下，但不能跪下;可以求名，但不能盗名;可以低落，但不能堕落;可以放松，但不能放纵;可以虚荣，但不能虚伪;可以平凡，但不能平庸;可以浪漫，但不能浪荡;可以生气，但不能生事。17、人生没有笔直路，当你感到迷茫、失落时，找几部这种充满正能量的电影，坐下来静静欣赏，去发现生命中真正重要的东西。18、在人生的舞台上，当有人愿意在台下陪你度过无数个没有未来的夜时，你就更想展现精彩绝伦的自己。但愿每个被努力支撑的灵魂能吸引更多的人同行。19、积极的人在每一次忧患中都看到一个机会，而消极的人则在每个机会中看到了某种忧患。莫找借口失败，只找理由成功。20、每一个成就和长进，都蕴含着曾经受过的寂寞、洒过的汗水、流过的眼泪。许多时候不是看到希望才去坚持，而是坚持了才能看到希望。1、这世上，没有谁活得比谁容易，只是有人在呼天抢地，有人在默默努力。2、当热诚变成习惯，恐惧和忧虑即无处容身。缺乏热诚的人也没有明确的目标。热诚使想象的轮子转动。一个人缺乏热诚就象汽车没有汽油。善于安排玩乐和工作，两者保持热诚，就是最快乐的人。热诚使平凡的话题变得生动。3、起点低怕什么，大不了加倍努力。人生就像一场马拉松比赛，拼的不是起点，而是坚持的耐力和成长的速度。只要努力不止，进步也会不止。4、如果你不相信努力和时光，那么时光第一个就会辜负你。不要去否定你的过去，也不要用你的过去牵扯你的未来。不是因为有希望才去努力，而是努力了，才能看到希望。5、人生每天都要笑，生活的下一秒发生什么，我们谁也不知道。所以，放下心里的纠结，放下脑中的烦恼，放下生活的不愉快，活在当下。人生喜怒哀乐，百般形态，不如在心里全部淡然处之，轻轻一笑，让心更自在，生命更恒久。积极者相信只有推动自己才能推动世界，只要推动自己就能推动世界。6、人性本善，纯如清溪流水凝露莹烁。欲望与情绪如风沙袭扰，把原本如天空旷蔚蓝的心蒙蔽。但我知道，每个人的心灵深处，不管乌云密布还是阴淤苍茫，但依然有一道彩虹，亮丽于心中某处。7、每个人的心里，都藏着一个了不起的自己，只要你不颓废，不消极，一直悄悄酝酿着乐观，培养着豁达，坚持着善良，只要在路上，就没有到达不了的远方！8、不要活在别人眼中，更不要活在别人嘴中。世界不会因为你的抱怨不满而为你改变，你能做到的只有改变你自己！9、欲戴王冠，必承其重。哪有什么好命天赐，不都是一路披荆斩棘才换来的。10、放手如拔牙。牙被拔掉的那一刻，你会觉得解脱。但舌头总会不由自主地往那个空空的牙洞里舔，一天数次。不痛了不代表你能完全无视，留下的那个空缺永远都在，偶尔甚至会异常挂念。适应是需要时间的，但牙总是要拔，因为太痛，所以终归还是要放手，随它去。11、这个世界其实很公平，你想要比别人强，你就必须去做别人不想做的事，你想要过更好的生活，你就必须去承受更多的困难，承受别人不能承受的压力。12、逆境给人宝贵的磨炼机会。只有经得起环境考验的人，才能算是真正的强者。自古以来的伟人，大多是抱着不屈不挠的精神，从逆境中挣扎奋斗过来的。13、不同的人生，有不同的幸福。去发现你所拥有幸运，少抱怨上苍的不公，把握属于自己的幸福。你，我，我们大家都可以经历幸福的人生。14、给自己一份坚强，擦干眼泪；给自己一份自信，不卑不亢；给自己一份洒脱，悠然前行。轻轻品，静静藏。为了看阳光，我来到这世上；为了与阳光同行，我笑对忧伤。15、总不能流血就喊痛，怕黑就开灯，想念就联系，疲惫就放空，被孤立就讨好，脆弱就想家，不要被现在而蒙蔽双眼，终究是要长大，最漆黑的那段路终要自己走完。16、在路上，我们生命得到了肯定，一路上，我们有失败也有成功，有泪水也有感动，有曲折也有坦途，有机遇也有梦想。一路走来，我们熟悉了陌生的世界，我们熟悉了陌生的面孔，遇人无数，匆匆又匆匆，有些成了我们忘不掉的背影，有些成了我们一生的风景。我笑，便面如春花，定是能感动人的，任他是谁。17、努力是一种生活态度，与年龄无关。所以，无论什么时候，千万不可放纵自己，给自己找懒散和拖延的借口，对自己严格一点儿，时间长了，努力便成为一种心理习惯，一种生活方式！18、自己想要的东西，要么奋力直追，要么干脆放弃。别总是逢人就喋喋不休的表决心或者哀怨不断，做别人茶余饭后的笑点。19、即使不能像依米花那样画上完美的感叹号，但我们可以歌咏最感人的诗篇；即使不能阻挡暴风雨的肆虐，但我们可以左右自己的心情；即使无法预料失败的打击，但我们可以把它当作成功的一个个驿站。20、能力配不上野心，是所有烦扰的根源。这个世界是公平的，你要想得到，就得学会付出和坚持。每个人都是通过自己的努力，去决定生活的样子。1、只要有坚强的意志力，就自然而然地会有能耐、机灵和知识。2、你们应该培养对自己，对自己的力量的信心，百这种信心是靠克服障碍，培养意志和锻炼意志而获得的。3、坚强的信念能赢得强者的心，并使他们变得更坚强。4、天行健，君子以自强不息。5、有百折不挠的信念的所支持的人的意志，比那些似乎是无敌的物质力量有更强大的威力。6、永远没有人力可以击退一个坚决强毅的希望。7、意大利有一句谚语：对一个歌手的要求，首先是嗓子、嗓子和嗓子我现在按照这一公式拙劣地摹仿为：对一个要成为不负于高尔基所声称的那种“人”的要求，首先是意志、意志和意志。8、执着追求并从中得到最大快乐的人，才是成功者。9、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。10、发现者，尤其是一个初出茅庐的年轻发现者，需要勇气才能无视他人的冷漠和怀疑，才能坚持自己发现的意志，并把研究继续下去。11、我的本质不是我的意志的结果，相反，我的意志是我的本质的结果，因为我先有存在，后有意志，存在可以没有意志，但是没有存在就没有意志。12、公共的利益，人类的福利，可以使可憎的工作变为可贵，只有开明人士才能知道克服困难所需要的热忱。13、立志用功如种树然，方其根芽，犹未有干；及其有干，尚未有枝；枝而后叶，叶而后花。14、意志的出现不是对愿望的否定，而是把愿望合并和提升到一个更高的意识水平上。15、无论是美女的歌声，还是鬓狗的狂吠，无论是鳄鱼的眼泪，还是恶狼的嚎叫，都不会使我动摇。16、即使遇到了不幸的灾难，已经开始了的事情决不放弃。17、最可怕的敌人，就是没有坚强的信念。18、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。19、意志若是屈从，不论程度如何，它都帮助了暴力。20、有了坚定的意志，就等于给双脚添了一对翅膀。21、意志坚强，就会战胜恶运。22、只有刚强的人，才有神圣的意志，凡是战斗的人，才能取得胜利。23、卓越的人的一大优点是：在不利和艰难的遭遇里百折不挠。24、疼痛的强度，同自然赋于人类的意志和刚度成正比。25、能够岿然不动，坚持正见，度过难关的人是不多的。26、钢是在烈火和急剧冷却里锻炼出来的，所以才能坚硬和什么也不怕。我们的一代也是这样的在斗争中和可怕的考验中锻炼出来的，学习了不在生活面前屈服。27、只要持续地努力，不懈地奋斗，就没有征服不了的东西。28、立志不坚，终不济事。29、功崇惟志，业广惟勤。30、一个崇高的目标，只要不渝地追求，就会居为壮举；在它纯洁的目光里，一切美德必将胜利。,