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试管苗玻璃化 论文试管苗玻璃化(论文) 2011年03月24日摘 要：试管苗玻璃化是植物组织培养中常见的现象，但目前对于玻璃化发生规律和机理尚无定论。可喜的是在玻璃化植株的解剖学特点、生理生化变化、形成原因及控制方法上取得了进展,相信组培这一生物技术必会因此而更加完善。 关键字：植物试管苗 组织培养 玻璃化 控制 植物组织培养中,常常可以观察到分化形成一些半透明状的畸形试管植物,这类植物体被称为“玻璃苗”,是植物组织培养中常见的现象。在离体培养中,再生植株成长为“玻璃苗”的现象称为“玻璃化现象”，又称过度水化现象。 自从 Phillips 和Mathews、Hackett 和Anderson最早描述了石竹茎尖培养时所出现的半透明状形态异常试管苗现象，及Debergh 等首先进行系统研究并提出玻璃化一词概念以来，植物组织培养中玻璃化发生的原因和防止措施逐渐受到较多的注意和研究。国内的研究者在玻璃化植株的解剖学特点、生理生化变化、形成原因及控制方法上取得了可喜的进展,但是对于玻璃化发生规律和机理至今尚无定论,只有不同侧面的阐述,尚未找到一个普遍适用的预防性措施和行之有效的解决方法，仍需要对玻璃化现象进行更系统和更深入的研究。 玻璃化苗的形态解剖学特征 从形态上看，与正常试管苗相比，玻璃苗发生显著的变化。玻璃苗外观显示的共同特点是呈半透明状，并且可分为外观形态明显异常与基本无异常两种类型。此外，玻璃苗的茎尖顶端分生组织相对较小，茎尖发育部分保持分生组织性的时期也缩短；叶表面缩小或增大，叶片常皱缩并纵向卷曲，脆弱易破碎，其颜色不正常，玻璃化苗难以生根。茎皮层及髓部的薄壁组织过度生长，细胞间隙大，输导组织发育不良或畸形，导管和管胞木质化不完全。叶片的栅栏组织细胞层数减少，或仅有海绵组织。叶肉细胞间隙大，表皮组织发育不良，包括叶表角质层变薄或缺少角质层蜡质，有的是蜡质发育不完全，或蜡质结晶的结构发生变化。果胶及纤维素等也发育不良。在有些植物玻璃化苗的叶表发现有大量的排水孔。气孔器数量或多或少，但功能不正常，其原因可能是保卫细胞中胼胝质含量增加，而纤维素含量减少。叶绿体中基粒和基质的组织结构异常，叶绿素含量低。根茎之间维管组织联系有缺陷。Miguens 等利用扫描电镜观察了曼陀罗正常苗与玻璃化苗叶片的表面结构，他们认为保卫细胞畸形是导致气孔功能异常的主要原因。 玻璃苗的生理生化特点 玻璃苗的过度含水、含水量高，还原糖和蔗糖、K+、Ca2+、Cl-的含量明显较高，而鲜重、干重、粗纤维、木质素、叶绿素和蛋白质、肌醇、Fe2+和Cu2+的含量明显较低。这表明玻璃苗的细胞壁发育差、细胞质膜透性改变、蛋白质合成能力和光合作用能力低下。 蛋白质含量及酶活性降低，新陈代谢紊乱。玻璃苗与正常苗相比，DNA含量不变，RNA含量降低，表明玻璃苗异常发生在转录以后而不是在DNA复制过程中。基因表达活性降低后，蛋白质合成受阻，蛋白质含量及酶活性降低，是分化不能正常启动，细胞器减少，光合作用和呼吸作用能力减弱，新陈代谢紊乱。 乙烯的合成增强。乙烯在胁迫条件下合成速度加快，乙烯过量能致使叶绿素分解及细胞的畸变，破换细胞结构。细胞壁解离的同时，细胞积累大量纤维素及泡状物质。众多试验也表明：玻璃化苗的叶片及茎尖中GA3、IAA、ABA 含量极显著上升，同时CTK 含量则显著上升，在茎叶极度玻璃化时CTK 含量显著降低，这可能与CA3、1AA 含量显著降低后植株的生理失调有关。以上所述是一些玻璃苗生理生化特点，这为探讨玻璃化发生的措施和研究玻璃苗发生的机理提供了有价值的参考资料。 玻璃苗可能的发生机制 从前述关于玻璃化的形态解剖学和细胞学研究表明，玻璃化的发生是从茎尖、从分生组织开始的，已经成长的组织、器官不可能再玻璃化，这也是符合最年幼部分耐逆性最差的常规概念。玻璃苗的细胞学特点是细胞质稀薄、细胞壁发育不好，实质上就是细胞分化受损。因此，关于细胞形态分化的研究资料可以为玻璃化发生机理研究提供有价值的线索。 玻璃化是植物组织培养中所特有的现象，在自然环境中的陆生植物未见有玻璃化现象存在。众多研究表明，玻璃苗绝大多数来自茎尖或茎切段培养物的不定芽，仅极少数玻璃苗来自愈伤组织的再生芽。已经玻璃化的试管苗，随着培养基和培养环境在培养过程中的变化是有可能逆转的，也可以通过诱导愈伤组织后再生成正常苗。导致玻璃化发生的因素很多，但不同植物种类的玻璃化诱发因素往往不同。除人为增加染色体导致玻璃化一例报告外，未见玻璃化发生与遗传直接有关的研究。因此，有关试管苗的玻璃化现象可以形成以下共识： 1）玻璃苗是在人工提供的培养基和培养条件下培养植物的产物。 2）与愈伤组织再生苗相比，从茎尖、茎段培养物直接增殖不定芽形成试管苗的进程快、时间短，至少有部分外植体分生组织还没有来得及适应新的环境。 3）试管培养不论试验设计千变万化，但有许多方面是相似的，如光照弱、培养容器内相对湿度接近饱和、氧气供应不足、培养基内各成分大多相似、无机供应处于完全速效状态和异养营养等等。但是不同植物生长分化的需求差异甚大。因此，对于比较相似的培养基和培养条件，不同植物所不能满足的需求是不相同的，这也可能是不同植物产生玻璃苗的原因的不同缘由。 4）可以认为，微繁殖中试管苗的玻璃化现象实际上主要是适应性的生理问题。 目前对组织培养玻璃化现象发生规律和机理还缺乏真正的了解。但是，就现在已经掌握资料对玻璃化发生机理形成一定的看法，是进一步深入研究机理和探讨控制玻璃化发生的技术措施的基础。 影响玻璃苗发生的因素 玻璃化现象发生在微繁殖试验中，是植物组织培养中特有的现象。因此,材料种类、培养基成分和培养条件等各种内外因素都影响玻璃苗的发生，其中研究较多的是培养基水势、细胞分裂素、氮源和碳源的状况。 玻璃化苗发生的材料差异 众多研究表明，培养材料的种类和外植体类型显著影响玻璃苗的发生。但是却难以确切说明不同植物种类、不同外体类型所产生的玻璃化程度不同的原因。也不能排除改变培养基后试管苗的玻璃化程度会发生显著变化。 培养基水势和环境湿度的影响 已经证实，液体培养比固体培养更容易产生试管苗玻璃化，提高培养器皿内空间相对湿度容易产生玻璃化，培养基水势和环境湿度对试管苗玻璃化有明显的影响。水分生理异常是玻璃化发生的原因，还是伴随的结果，有待于进一步研究。 碳源的影响 有关碳源供应状况对玻璃化影响的研究还不多见。对矮牵牛等众多玻璃苗叶片的研究发现，玻璃苗的还原糖含量明显较高、肌醇含量明显较低。因此，碳源供应状况对玻璃化发生是有影响的，但尚需要继续进行探讨。 无机盐和离子的影响 培养基中的 NH4+过多容易导致玻璃苗的发生。培养基中氨态氮比例愈低，则玻璃苗率和病情指数愈小，在一定范围内降低培养基中的氨态氮的比例有利于防止或减轻玻璃苗的产生。也有实验表明：提高培养基中的K+或Ca2+浓度可以降低玻璃苗的发生，这与玻璃苗含高水平的K+和Ca2+的报道不符，意味着NH4+、K+和Ca2+对玻璃苗发生影响的复杂性，他们的影响可能还受其他因素的制约。此外，提高培养基中的Zn2+、Mn2+浓度可以减少玻璃苗的形成，而Cl浓度过高易导致玻璃化发生。 外源激素的影响 玻璃化苗发生百分率和细胞分裂素成正相关，其中BA 的影响大于ZT。牛自勉、任东植等都发现：高浓度的6-BA 对玻璃化的产生有一定的促进作用。 温度 5左右的低温处理可以克服试管苗玻璃化现象，但必须注意重新转入高温培养和继代培养时玻璃化现象的恢复。此外40热击处理也可消除瑞香愈伤组织再生苗的玻璃化。Cears 等报道，热击可以降低内源细胞分裂素的水平，这也许是热击可以消除玻璃苗的原因。 光照 黑暗和弱光培养容易形成玻璃苗，而光照则可以显著降低玻璃苗百分率。 培养基中添加根皮苷或活性碳能够减轻试管苗玻璃化现象，而添加水解酪蛋白则使玻璃苗百分率增加。 培养基pH值对玻璃苗发生也有影响。郭初达等报告，在pH 5.87.0 范围内，玻璃苗百分率以pH 6.2 时最高，pH 7.0 时最低。所以研究玻璃化现象时应注意培养基的pH 值。 青霉素可以诱导赤霉素合成的有关 mRNA，而且能抑制愈伤组织中过氧化物酶和IAA氧化酶的活性，从而提高IAA 含量。同时它一方面通过促进叶片中核酸和蛋白质的合成来促进叶绿素的合成，另一方面通过降低叶片中叶绿素酶的活性来延缓叶绿素的降解，从而提高叶片中叶绿体色素的含量。 待添加的隐藏文字内容2聚乙烯醇（PVA）和青霉素G 钾和对试管苗玻璃化也有影响。 此外内源激素水平随季节的变化，会导致试管苗的玻璃化率在春夏季较高，冬季较低。 防止玻璃苗发生的经验措施 随着玻璃化产生机理研究的深入,某些植物的玻璃化已得到了有效的控制。在控制玻璃苗发生时,大多研究者均采用如下措施: 选不易玻璃化的基因型及部位做外殖体。注意通气以尽可能降低培养基中的空气相对湿度和改善氧气供养状况。选择适宜的碳源及外源激素的种类和浓度。并注意生长素与分裂素的配合,尽量兼顾繁殖系数。用光照培养,适当提高光照强度。适当降低培养基中NH4+ 的浓度,并及时转移,以免氨累积。适当提高培养基中无机盐含量。添加有机物,有效地抑制了玻璃苗形成。添加植物激素合成前体如ACC。利用固体培养基,琼脂浓度不低于0.8%，,从根本上降低培养基中的水势等。 虽然试管苗玻璃化后偶尔可在延长培养期间恢复正常，也可通过诱导形成愈伤组织后重新分化生成正常苗，但通常玻璃苗恢复正常的比例很低，继代培养中仍然形成玻璃苗，且玻璃苗的分化能力低下，难以增殖生根成苗。由于玻璃苗的生理功能异常，难以移栽成活。因此玻璃苗的出现对于利用植物组织培养技术进行植物快速微繁殖是不利的。而通过对玻璃化的研究，必然会推动以组培为基础的部分生物技术更加完善。 参考文献 1牛自勉,王贤萍,戴桂林等. 苹果砧木玻璃化过程中内源激素的含量变化. 华北农学报,1995 2陈国菊, 雷建军. 芥菜离体培养中玻璃化机理的研究J. 西南农业大学学报, 2000, 3高国训,李光晨,张潞生. 逆转苹果试管苗玻璃化的研究J . 华北农学报,1997 4 黄荣韶, 覃伟. 无籽西瓜离体培养中玻璃化现象的研究J. 广西农业大学学报, 1998, 5任东植, 李峰, 曲运琴, 等. 影响枣组培苗玻璃化的几个因素及其防治(简报)J. 植物生理学通讯,2000 47470560546r30546r30546r3