生物化学第九章 DNA生物合成课件.ppt
第九章 DNA生物合成 周口师范学院生命科学系(2008.12),主要内容,第一节 DNA的复制第二节 DNA的损伤与修复第三节 逆转录和其它复制方式第四节 DNA的体外复制-PCR,基因信息的传递,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP,DNA,复制（DDDP）,转录（DDRP）,翻译,RNA,复制（RDRP）,反转录（RDDP）,第一节 DNA的半保留复制,一、概念和实验依据二、DNA聚合反应的条件三、DNA的复制的起始点和方式四、原核细胞DNA的复制过程五、真核细胞DNA的复制六、DNA复制的忠实性,DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。,一、概念和实验依据,半保留复制模型,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,DNA半保留复制的实验证明：,DNA半保留复制研究实验结果示意图,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Cairns实验),将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标记的；另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。,1）底物(substrate)2）模板(template)3）引发体和RNA引物4）各种酶系5)单链DNA结合蛋白,二 DNA复制的条件,以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。,1）底物(substrate),DNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应,DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,2）模板(template),引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,3）引发体和RNA引物,在E.coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome)。,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,4)DNA复制的酶类,a.引物酶(peimase)和引发体(primosome)b.DNA聚合酶(DNA polymetases)c.DNA连接酶（DNA ligase）d.DNA解螺旋酶(DNA helicase)e.拓扑异构酶(topoisomerase)(兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。),DNA复制酶类作用点模型,DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase,DDDP)简称：DNA-pol活性：1.53 的聚合酶活性 2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol 和pol。,种类和生理功能,pol 为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow fragment。,Klenow片段的分子结构,pol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。,pol 的二聚体结构,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,原核生物三种DNA聚合酶比较,真核生物五种DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶,DNA连接酶的连接作用,DNA连接酶催化的条件 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用,解螺旋酶，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,解螺旋酶(helicase),DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),人类拓扑异构酶的分子结构,能够松解DNA超螺旋结构的酶,DNA复制过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶的作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,DNA拓扑异构酶的作用机制,单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB），又称螺旋反稳蛋白(HDP)，是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,5）单链DNA结合蛋白,SSB的生理作用,使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin)。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,1)有一定的复制起始点,三、DNA的复制的起始点和方式,细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,DnaA,DnaB(解螺旋酶),SSB,大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,复制子和复制叉,复制起始点与复制子示意图,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,DNA复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,2)双向复制(bidirectional replication),DNA的双向和单向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),DNA的双向复制示意图,参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,3)需要引物,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,4)半不连续复制(semi-discontinuous replication),领头链(leading strand),随从链(lagging strand),DNA的半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链和随从链,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,冈崎片段(Okazaki fragment),四、原核细胞DNA的复制过程,1）复制的起始2）复制的延长 3）复制的终止,DNA复制的起始阶段，由下列步骤构成。a.识别起始点：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；b.解旋解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。c.SSB结合：单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。d.合成引物：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,1）复制的起始,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,2）复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA复制的延长过程,领头链的合成过程,随从链的合成过程,DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成,DNA复制过程简图,3）复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（a）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的双螺旋DNA长链后分开。,（2）连接冈崎片段，分开子代DNA,随从链上不连续性片段的连接,五、真核细胞DNA的复制,真核生物DNA复制的特点真核生物的DNA聚合酶端粒和端粒酶（telomerase）,真核生物DNA复制的特点,A、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。,C、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000bp/min(仅为原核生物的1/201/50）。,真核细胞DNA复制的特点,多个起点复制,真核生物的DNA聚合酶,真核细胞DNA复制示意图,真核和原核DNA细胞复制比较,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物端粒和端粒酶,功能,维持染色体的稳定性 保证DNA复制的完整性,端粒的结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短 序列。,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，实质上是一种逆转录酶，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶的组成和作用,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶的作用机制爬行模型,端粒酶的爬行模型（动画演示）,六 DNA复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程。据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:,DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为7 10-6）,DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）,起始时以RNA作为引物,复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切酶活性。,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,起始时以RNA作为引物的作用,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,第二节 DNA的损伤（突变）与修复,一、DNA突变及意义二、引起DNA突变的因素三、DNA突变的分子改变类型四、DNA损伤修复机制,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。,一、DNA突变及意义,突变是进化、分化的分子基础突变导致基因型改变突变导致死亡突变是某些疾病的发病基础,（1）自发因素：自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,二、引起突变的因素,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,（2）物理因素：,嘧啶二聚体的形成,脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,（3）化学因素：,烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。碱基类似物：如5-FU，6-巯基嘌呤（6-MP）等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,三、突变的分子改变类型,DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshift mutation),DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation),点突变(point mutation),镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,血红蛋白-亚基的点突变,缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入 原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,框移突变,缺失引起的框移突变,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,重排(重组Recombination),DNA损伤修复(repair)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态,光修复(light repair)切除修复(excision repair)重组修复(recombination repair)SOS修复,修复的主要类型：,四、DNA损伤修复机制,这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,1）光修复（light repair）,其修复过程为：a.光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。b.在300-600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。c.光修复酶从DNA上解离。,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,2）切除修复(excision repair),DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。修复时，利用重组蛋白的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。,3）重组修复(recombination repair),DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,这是一种特殊的有差错修复机制,当DNA受到较大范围损伤,复制难以进行,细胞处于危机状态.此时,DNA复制短暂抑制,细胞可诱导产生新的缺乏校对功能的聚合酶,它能在DNA损伤部位进行复制而避免死亡,但变异率较高过程中所采用的方式。,4）SOS修复,第三节 逆转录和其它复制方式,一、概念和生物学意义,二、逆转录酶,三、病毒逆转录过程,四、DNA的其它复制方式,一、概念与意义,以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：扩充了中心法则,至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,二、逆转录酶,三种功能,三 逆转录病毒细胞内的逆转录过程,逆逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,四 滚环复制和D环复制,滚环复制(rolling circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制的过程,线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,D环复制(D-loop replication),第四节 PCR(polymerase Chain reaction),聚合酶链式反应,PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适和条件下，由耐热的Taq DNA聚合酶催化引物由5 3 扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。经过3050个循环，可使原DNA量增加106109倍。,PCR的主要步骤：模板DNA的变性 一般选用95左右1min，使DNA双链解为单链 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min 延伸 一般72 1min 循环数 按初始模板浓度确定，一般2545之间,PCR的引物设计 PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键.引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200800bp之间 引物的长度 一般为1825bp 末端核苷酸 3端不得有任何修饰 GC含量和Tm值 一般在4060%之间，两条相差23,
