第十一章RNA的生物合成课件.ppt

第 十 一 章,RNA的生物合成（转录）RNA Biosynthesis,Transcription,第一节 模板和酶第二节 转录过程第三节 真核生物的转录后修饰,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,转录生成的产物：主要有rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和hnRNA。,复制和转录的区别,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,第一节 模 板 和 酶,一、转录模板二、RNA 聚合酶 三、酶与模板的辨认结合,一、转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。模板链/有意义链/Watson链：DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称。编码链/反义链/Crick链：与模板链互补的另一股单链。,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t c a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,转录的特点,转录的连续性,转录的单向性,有特定的起始和终止位点,（转录单位：指特定起始点和特定终止点之间的DNA链；通常由转录区和有关的调节顺序构成。）,二、RNA聚合酶（DDRP）,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),大肠杆菌中RNA 聚合酶（DNA dependent RNA polymerase）,全酶,核心酶,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,-35,（二）真核生物的RNA聚合酶,酵母RNA聚合酶和示意图,三、模板上酶的辨认、结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,启动子（promoter),启动子（promoter)：位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合及起始转录有关的一些DNA顺序称为。,RNA聚合酶保护法,目 录,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),原核生物中转录起始区的共同序列,TTGACAN17,TTTACAN16,TTTACAN17,TTGATAN16,CTGACGN18,被RNA聚合酶保护的DNA区段碱基序列分析1-5行举出几个具体操纵子的分析结果6,7行示对45个操纵子分析后得出的一致性序列,TTGACA TATAAT,X/4.5 38 36 29 40 25 30 37 37 28 41 29 44,trp,tRNAtrp,lac,recA,ara,最大一致性,TTAACT N7 A,TATGAT N7 A,TATGAT N6A,TATAAT N7A,TACTGT N6A,35区,10区,+1,Pribnow box,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,第二节 转录过程,转录的起始转录的延伸转录的终止,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,2.DNA双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程,RNA聚合酶,OH,转录方向,模板链,5-pppGRNA,由RNA聚合酶、DNA、转录产物RNA组成的转录复合物（转录空泡）,DNA,F,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA聚合酶,编码链,模板链,RNA,PPi,5,5,3,3,5,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,转录的延长,3,起,终,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,A T P,1.依赖 Rho因子的转录终止,1969，J.Roberts，因子,rho,rho,Polymerase,Polymerase,Rho 因子的作用原理RNA链上带条纹线的代表富含C的区段。Rho因子结合RNA（右），发挥其ATP酶及螺旋酶活性,5,RNA,+ATP,5,3,3,2.非依赖 Rho因子的转录终止（自动终止）,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列（富含GC和AT的区域），转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,TTGCAGCCTGAGAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT,UUUUU.,A,B,C,A,大肠杆菌核糖体蛋白L基因3端碱基序列（上）及其转录产物可能形成的两种二级结构形式（下）,B,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,启动子,结构基因,终止区,1.,5,5,核心酶,2.,3.,4.,Gppp,5.,6.,5,pppG,7.,5,pppG,8.,5,mRNA,转录过程1,2.待转录的基因;3至5 的单股为有意义链;3,4.起始:全酶结合于有启动区;5.第一个pppG加入;6.因子释出后开始延长;7.终止:因子加入,核心酶释出;8.转录完成,核心酶,F,二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),1.转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,顺式作用元件(cis-acting element)：DNA分子上具有的可影响（调控）转录的各种组分。,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，统称为反式作用因子(trans-acting factors)，现已发现数百种。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,TF I、TF II、TF III,参与RNA-pol转录的TF,3.转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,4.拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,F,原核生物与真核生物转录的异、同点,原核生物,真核生物,转录的起始,由2+DNA模板+pppGpN-OH3 形成转录起始复合物,形成转录起始复合物，需要转录因子的参与。,转录起始点,-35区及-10区,-25-30区,转录的延长,基本相似，只是催化的酶不同，都是转录空泡沿着模板链向前滑动，转录出相应的RNA，但真核生物需要许多转录因子参与，且转录与翻译不同步。,转录终止,依赖因子、和非依赖因子识别特异的终止信号。,依赖模板链末端特殊的转录终止修饰点,真核生物的转录后修饰Post-transcriptional Modification,第三节,转录生成的RNA是初级产物（primary transcripts）；原核生物和真核生物的初级转录产物都需要经过一定程度的加工才具有活性；,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),1、加帽(adding cap)：即在mRNA的5-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即对nRNA进行加帽。帽子结构功能：和翻译过程有关。原核生物没有帽子结构。,帽子结构,5 pppGp,帽子结构的生成,2加尾(adding tail)：,这一过程也是在细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期、活性及增加其稳定性有关。,（二）mRNA的剪接,1.hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclear RNA,hnRNA)snRNA(small nuclear RNA),真核生物nRNA的剪接一般需snRNA（1、2、4、5、6）参与构成的核蛋白体（剪接体）参加，通过形成套索状结构而将内含子切除掉。,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，为一个连续氨基酸组成的完整蛋白质编码，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,2.外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,目 录,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,3.内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,4.mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,目 录,F,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twice transesterification),RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,5.mRNA的编辑(mRNA editing),真核生物mRNA的转录后加工修饰示意图,二、tRNA的转录后加工,真核生物的tRNA由RNA-pol III催化，然后加工成熟。主要有以下几种加工方式：剪接；化学修饰；包括甲基化（、）、还原反应（）、核苷酸内的转位反应（）、脱氨基反应（）及3 末端加上CCA-OH末端；,tRNA前体,目 录,目 录,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,目 录,碱基修饰,目 录,三、rRNA转录后的加工,真核细胞的rRNA基因属于丰富基因族的DNA序列；丰富基因族的DNA序列：即染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因（tandem gene）单位的重复（高度重复序列）。rRNA的剪接不需要任何蛋白质参与即可以发生，因此，有活性的RNA叫核酶。,四、核 酶,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,四膜虫前体rRNA的自身剪接示意图,四膜虫RNA的自我剪接,最简单的核酶二级结构槌头状结构(hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶破坏病毒等病原微生物。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,目 录,