第十三章 DNA 生物合成课件.ppt

第十三章 DNA 生物合成,内容提要,DNA 的半保留复制依赖 RNA 的 DNA 合成DNA 损伤与修复,2.1修复机制,1.光复活,T T,紫外线(260nm),T(胸腺嘧啶）二聚体,双键打开,T-T二聚体,只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例 对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。,光复活酶结合于损伤部位,2.切除修复,核酸酶,属于复制前的修复。,3.重组修复,复制同时的修复,*,DNA聚合酶、连接酶补缺,提问：原损伤部位没有修复，对后代影响大吗？,在后代中只有一个个体含有该条DNA，后代越多，影响比例越小，等于消除影响。,4.SOS修复,SOS求救信号DNA损伤严重，复制受到抑制，前几种方法难以奏效时：,诱导校对能力差的DNA聚合酶形成，局部“乱配”,进化、变种、癌症、诱变育种等等都是基于这一机理。,为了生存变。,第一节 DNA 的半保留复制,DNA 半保留复制的理论参与 DNA 复制的酶复制的起点和方式复制过程,一、DNA 半保留复制的理论,半保留复制的实验依据和意义双向复制复制的半不连续性,（一）半保留复制的实验依据和意义,半保留复制的实验依据半保留复制的概念半保留复制的意义复制的半不连续性,1.半保留复制的实验依据,1958年，Meselson 证明：用，15NH4Cl 唯一氮源培养大肠杆菌，之后，用 14NH4Cl 培养，然后进行 CsCl2 进行密度梯度离心。由于 15NH4Cl 密度大于 14NH4Cl，因此，形成不同区带，经过若干代培养后，两个 NH4Cl 区带增多。,2.半保留复制的概念,DNA 生物合成时，母链 DNA 解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的 DNA 都和亲代 DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,3.半保留复制的意义,按半保留复制方式，子代 DNA 与亲代 DNA 的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,（二）双向复制,原核生物的 DNA 双向复制真核生物的 DNA 双向复制,1.原核生物的 DNA 双向复制,原核生物复制时，DNA 从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点,A.环状双链 DNA 及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),2.真核生物的 DNA 双向复制,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,3.复制的半不连续性,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链（先导链）。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链（滞后链）。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链（先导链）(leading strand),随从链（滞后链）(lagging strand),二、参与 DNA 复制的酶,DNA 聚合反应DNA 聚合酶DNA 连接酶DNA 解旋相关酶类引物酶(Primase)和引发体,参与 DNA 复制的物质,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖 DNA 的 DNA 聚合酶，简写 为 DNA-pol模板(template):解开成单链的 DNA 母链引物(primer):提供 3-OH 末端使 dNTP 可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,（一）DNA 聚合反应,聚合反应方程式聚合反应的特点,1.聚合反应方程式,PPi 随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,2.聚合反应的特点,以四种脱氧核苷三磷酸为底物；DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿 5 3 方向进行；产物 DNA 的性质与模板相同。反应需 Mg+激活。,（二）DNA 聚合酶,原核生物的 DNA 聚合酶真核生物的 DNA 聚合酶,1.原核生物的 DNA 聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol IVDNA-pol V,1)大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min,DNA聚合酶,DNA聚合酶（复合物）,109，000400+1校读,修复1000,120，00040+-0.05,400，00010-20+50复制100000,特 性,不清填补缺口50,5 ucgagcuag-OH 3,5 ucgagcuag,2)53聚合作用,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5,catcggatcgcatcgtcacgtgctag 3,5,3,内切酶,外切酶,3)外切酶与内切酶作用图解,53外切酶活性的功能,切除引物，切除突变片段,4)35 外切酶活性,小片段,大片段（Klenow fragment）,5 3 聚合功能 3 5 外切酶活性,53外切酶活性,5)DNA pol I,功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol：由十种亚基组成，其中亚基具有 53 聚合 DNA 的酶活性，因而具有复制 DNA 的功能；而 亚基具有 3 5 外切酶的活性，因而与 DNA 复制的校正功能有关。(250 kD),6)DNA-pol,2.真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol:起始引发，有引物酶活性。DNA-pol:参与低保真度的复制。DNA-pol:线粒体 DNA 复制中起催化作用。DNA-pol:延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol:复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在真核生物中，目前发现的 DNA 聚合酶有五种，分别命名为 DNA 聚合酶（pol），DNA 聚合酶（pol），DNA 聚合酶（pol），DNA 聚合酶（pol），DNA 聚合酶（pol）。其中，参与染色体 DNA 复制的是 pol（延长随从链）和 pol（延长领头链），参与线粒体 DNA 复制的是 pol，pol 与 DNA 损伤修复、校读和填补缺口有关，pol 只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。,真核生物的DNA聚合酶,3.DNA 连接酶,DNA 连接酶(DNA ligase)作用方式DNA 连接酶催化的条件功能,1)DNA 连接酶(DNA ligase)作用方式,连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的 DNA 链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,2)DNA 连接酶催化的条件,DNA 连接酶催化的条件是：需一段 DNA 片段具有 3-OH，而另一段 DNA 片段具有 5-Pi 基；未封闭的缺口位于双链 DNA 中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由 NAD+供能，在真核生物中由 ATP 供能。,3)功能,DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在 DNA 修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,4.DNA 解旋相关酶类,解旋酶(helicase)拓扑异构酶（topoisomerase I、II）单链 DNA 结合蛋白(SSB),解螺旋酶、引物酶和单链 DNA 结合蛋白,dnaA、B、C,DnaA、B、C,ATP,1)解旋酶(helicase),利用 ATP 供能，作用于氢键，使 DNA 双链解开成为两条单链,拓扑(topology)与拓扑异构,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,超螺旋,螺旋,2)拓扑异构酶（Topo）,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,Topo 酶：切割 DNA 链，使其松弛后再连接,Topo（DNA Gyrase）,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,ATP,TOPO,3)单链 DNA 结合蛋白（SSB）,作用：防止单链 DNA 重新形成双链，防止单链 DNA 被核酸酶水解,SSB,5.引物酶(Primase)和引发体,引物酶(primase)DNA 合成需在 RNA 引物的基础上进行，复制起始时催化生成 RNA 引物的酶引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。,DnaA,引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域,小 结,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶 解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,三、复制的起点和方式,复制起点复制方向复制方式,（一）复制起点,复制起点（origin,ori或 o,复制原点）复制开始处:DNA分子的特定位置,原核生物（Prokaryote）：单复制起点 即整个染色体只有一个复制单位,真核生物（Eukaryote）:多复制起点 即一个genome中有多个复制单位,（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉,单向复制,双向复制,（二）复制方向（复制过程的顺序性）,（2）复制的多模式,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,多起点、双方向（真核）,（三）复制方式,大多数以对称方式进行即两条链同时复制也有一定时期内 DNA 只复制一条链的情况,（1）复制或从新起始（de novo initiation）或复制叉式（replication fork）双链环状 DNA 的复制眼可以形成一种 结构，形状像 希腊字母，因而叫.,单、双向 复制模式图,（2）D 环复制（Displacement form）又称置换式 线粒体和叶绿体 DNA的复制方式,（3）复制或滚环式复制（rolling circle replication）或共价延伸方式（covalence elongation）由于复制时产生的滚环结构形状象，称复制 病毒、细菌因子，如含有单链环状DNA的X174、G4、M13,(4)线性 DNA 双链的复制单一起点、单向，如：腺病毒单一起点、双向，如：T7噬菌体多个起点、双向,四、复制过程,原核细胞 DNA 的复制合成真核细胞 DNA 的复制合成,1.旋转酶解开超螺旋。,旋转酶,（一）原核细胞DNA的复制合成,2.解螺旋酶在起点双向打开螺旋,起点,解螺旋酶解开双链,解螺旋酶,3.DNA结合蛋白与单链结合并向前移动,DNA结合蛋白,提问：DNA结合蛋白的作用？,A,T,G,C,防止单链复合,起点,A,T,C,C,A,T,T,小段RNA引物,RNA聚合酶,4.RNA聚合酶催化起点处通过碱基互补连接引物RNA链。,作用确定起始部位，引导复制开始。,AU GC,6.新链53延长（复制DNA）,5.引物3连接dXTP,E.COLi的DNA聚合酶,功 能 53聚合作用+53外切酴作用+35外切酶作用+聚合核苷酸数/min 600 30 9000分子数/细胞 400 100 10*DNApol主要负贡DNA链延伸。,起点,？,？,父代DNA两链方向相反,必然无法连续复制,7.均以53方向形成前导链和滞后链,由冈崎片段连接成的新DNA链称滞后链。,与复制叉移动方向相同，可以一直复制到底的新DNA链称前导链。,5,3,5,8.切除引物，补缺。,DNA聚合酶35核酸外切,连接酶连接缺口,切除引物、切除配错dXTP,新链,前导链连续复制,滞后链不连续复制,DNA复制为53半不连续复制。,半保留复制结果半不连续复制过程,（二）真核细胞DNA的复制：（DNA指导的DNA合成）,真核生物与原核类似，但更复杂，不同之处：1.DNA 模板上有多个起点，即真核细胞 DNA复制由多个复制子共同完成。,2.有 5 种DNA聚合酶，各具功能：,复制 DNA：后滞链；前导链；修复 DNA：、；复制线粒体 DNA：；引物合成：。,第二节 RNA 指导的DNA 合成,反转录是以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。这是DNA生物合成的一种特殊方式。,反转录酶都具有多种酶活性DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3末端以53方向合成DNA。反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5端水解掉RNA分子。DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，,生物学意义,（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。,第三节 DNA 损伤与修复,光复活切除修复重组修复SOS修复,T T,紫外线(260nm),T(胸腺嘧啶）二聚体,双键打开,光复活,T-T二聚体,只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例 对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。,光复活酶结合于损伤部位,核酸酶,属于复制前的修复。,2.切除修复,3.重组修复,复制同时的修复,*,DNA聚合酶、连接酶补缺,在后代中只有一个个体含有该条 DNA，后代越多，影响比例越小，等于消除影响。,4.SOS 修复,SOS求救信号DNA损伤严重，复制受到抑制，前几种方法难以奏效时：,诱导校对能力差的DNA聚合酶形成，局部“乱配”,进化、变种、癌症、诱变育种等等都是基于这一机理。,为了生存变。,