第32章rna的生物合成与加工课件.ppt

第32章 RNA的生物合成与加工,转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。,原核细胞的mRNA为单顺反子或多顺反子。,真核细胞的mRNA为单顺反子。,有义链，编码链；反义链，模板链,E.coli 的RNA聚合酶中，2称为核心酶。,因子辨认模板DNA的起始位点。,基因的转录 mRNA的合成,基因转录是以DNA为模板合成与其碱基顺序互补的mRNA的过程。细胞生长周期的某个阶段，DNA双螺旋解开成为转录模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我复制，即其本身不能作为复制模板，因此在转录过程中即使出现某些差错，也不会遗传下去。,基因表达的第一步,以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板,在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下,模板单链 DNA的极性方向为3 5,而非模板单链 DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3.,DNA,(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向),3-TACTCAT-5,RNA 5-AUGAGUA-3,5-ATGAGTA-3,Non-template(sense strand),template(antisense strand),若 干 基 本 概 念,某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录）,RNA的转录包括promotion,elongation,termination 三过程,从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为转录单位（transcriptional unit）,原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon,转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值,真核生物中的转录单位多为monocistron,No operon,转录过程,mRNA合成,注意：RNA聚合酶与启动子结合启始转录 RNA的合成从5，到3，模板是3，到5，只有一条DNA链可以转录 转录后DNA恢复双链结构,体外，两条DNA均可转录DNA以全保留的方式转录核心酶可以延伸，因子启始合成、识别启动子转录速度比复制慢，与翻译速度相近因子的存在影响核心酶的构象：降低了酶与DNA的结合常数与停留时间增加了与启动子的结合常数和停留时间起始后因子脱离，RNA延伸不同的因子识别不同类型的启动子,转录过程的选择性抑制,放线菌素D是原核和真核细胞RNA聚合酶的专一抑制剂。,利福平是原核细胞RNA聚合酶的抑制剂。,-鹅膏蕈碱是真核细胞RNA聚合酶的抑制剂。,第一节 RNA转录合成的特点,一、转录的不对称性,转录(transcription)的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。,有意义链,反意义链,5,5,3,3,5,5,对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链），而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。,二、转录的连续性,RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。,合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信息，则称为多顺反子。,三、转录的单向性,RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。,四、有特定的起始和终止位点,RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点，特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。,第二节 RNA转录合成的条件,一、底物,四种核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。,二、模板,以一段单链DNA作为模板。,三、RNA聚合酶,这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合RNA。,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即2。亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（2）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。,大肠杆菌RNA聚合酶全酶,Rifampin是RNA合成起始的抑制剂,真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由1012个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,酵母RNA聚合酶和,四、终止因子,1蛋白：这是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。该蛋白因子能识别终止信号，并能与RNA紧密结合，导致RNA的释放。,2nusA蛋白：为一分子量69kd的酸性蛋白，它能与RNA及RNA聚合酶相结合，在终止部位使两者被释放。,NusA protein;,69 Kd,acid protein,RNApol-attaching factor,Impel RNApol.pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA,(antitermination N protein utilization substance),五、激活因子,目前已知激活因子为降解产物基因激活蛋白（CAP），又称为cAMP受体蛋白（CRP）。是一种二聚体蛋白质，亚基分子量为23kd。该蛋白与cAMP结合后，刺激RNA聚合酶与起始部位结合，从而起始转录过程。,第三节 RNA转录合成的基本过程,一、识别,原核生物RNA聚合酶中的因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。,被辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。RNA聚合酶识别,酶与该区结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒），并启动转录。有利于DNA局部解开双链,原核生物中转录起始区的共同序列,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA顺序称为启动子（promoter)。转录起始的第一个核苷酸是pppG或pppA,Core promoter region including,-35(R),-10(B),+1(I),RNA,l Sextama Box 与Pribnow Box 间距17bp,有利于RNApol启动,l Sextama Box or Pribnow Box mut.,间距趋近于17 bp，up mutation,间距远离于17 bp，down mutation,17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要,Sextama Box and Pribnow Box mut.,转录率下降100X,转录率下降1000X,因子；,重复使用(Re-usable),使 Holo-enzyme识别Sextama Box,与模板链结合,修饰 RNApol 构型，,降低全酶与DNA的非专一性结合力（107/mol）,增强全酶与R,B site的专一性结合力(1014/mol),导致RNA链的延伸缓慢,Promoter与factor 间的结合专效性,决定了 strong promoter&weak promoter,不同启动子的-35，-10区序列间存在较为 保守的标准序列(标准启动子),启动子中-35,-10 区序列的差异影响与 RNApol 中 因子的结合能力,factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.,真核生物的转录起始区上游也存在一段富含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒。,除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性的序列，如CAAT盒及GC盒等。,Promoter for basic transcription(class II recognized by RNA polymerase II),l Cap site;initiation point(+1)Capping m7GpppA/G-70-AUG-(in mRNA),Promoter for basic transcription,l TATA box/Hogness box/Goldberg-Hogness box(-30)Rich AT and rich GC flanked rich GC-T A T A A(T)A A(T)-rich GC 82 97 93 85 63(37)83 50(37),Promoter for basic transcription,l GC island(C no methylated)and CAAT box(CAT box UPE)(-70)GCGC-GGC(T)CAATCT-Response to effect of transcription Range 30 bp,l Promoter functions CAAT box(modulator)controlling transcriptional efficiency(cause GC island)TATA box(selector)controlling starting point and efficiency I site(initiator)determination initiation point and capping of mRNA,真核生物的转录起始较为复杂。目前已知RNA聚合酶至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（trans-criptional factor,TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。,Cis-factor for inducible expression,HSE(Heat Shock Element)GRE(Glucocoricoid Response Element)糖皮质激素应激元件MRE(Metal Response Element)TSE(Tissue Special Element),l Inducible expressed by environment,Ig ATGGAAAT+Oct-2 factor B 细胞表达GH ATGAATAT+Pit-1 factor 脑下垂体表达,l Enhancer,Enhance expression Basic expression,Position not be fixed isolated region,Bi-directional element Mono-directional element,Enhancer与Promoter的比较,Chambon discovered the first enhancer inthe 5-flanking region of the SV40 early gene.,Enhancer 的结构与功能,-Enhancer 由两个以上的增强子成分(Enhancer Element)组成,-Enhancer Element 必需由两个紧密相连,具有间距效应的 增强子元(Enhanson）组成,-各个Enhanson(cis-factor)与激活蛋白(trans-factor)结合,增强特异性转录,e.g.SV40 Enhancer(-179-250),远距离控制，无方向性,Silencer Mating type(MAT)of yeast,Silencer can act at a distance(at least 1 kb away)to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes,转录因子 功 能 TFA 稳定TFD结合 TFB 促进pol 结合 TFD 辨认TATA盒 TFE ATPase TFF 解旋酶,真核生物RNA聚合酶转录因子及其功能,与基本转录相关的trans-factor,Trans-factor for basic transcription,l TF(I,II,III)Transcriptional Factor,l TBP(TATA box Binding Protein),l TAF(TBP Associate Factor),l RAP(RNApol.Associate protein),真核生物中RNApol的作用必须有其他相关转录蛋白在启动子处的先期结合才能启动转录,RNApol II(B);-For pre-mRNA transcription-Located in nucleoplasm-L maximum subunit 240 kd 7aa repeats&high frequency phosphorylation TyrSerPProThrPSerPProSerP,Yeast 26XDrosophila 44X repeat unit of 7 aa/in CTDRat&Human 52X,-依CTD中，Ser,Thr 磷酸化与否，将L 分为3个Subforms,IIO(240kd)IIA(220kd)IIB(180kd),高度磷酸化CTD over-phosphorylated,提高转录效率10X IIA,蛋白酶水解Non-physiological form,基本形式 Initially binds to promoter,(TBP);needed for RNApol I,II,III Very high conserved C-end domain of 180 aa Binds with DNA in minor groove&wilds it Determination initiation starting site Control UPE effect for basic transcription,TFIID;A sort of protein complex(TBP&8 TAF),Promoter clearance,Transcription starting,F,Wilds minor groove,pre-TIC,Basic TIC,conclusion,Promoter clearance,Transcription starting,complete TIC,Different acidic activation domain may regulation different cis-factor targets,真核生物以多种转录因子复合体方式（多种组合）与cis-factor 结合，激活转录,表现一种复杂而又灵活的 positive control system,activator 的活性调节 受到严格的信号因子的调控,signal,binding DNA,变构,活化状态,激活转录,种类与结构特点,lCys/Cys,Cys/His(Zinc finger),DNA-binding domain,l Helix()-turn-Helix()(HTH),种类与结构特点,lHomeodomains(HDs 60aa with HTH),9 direct repeats 30aa/copy,2Cys/2His or 2Cys/2Cys types,2Cys(2C)Zn 2His(2C)to form finger of 1-helix&1-sheet,Zinc finger,Aaron Klug(1985)TFIIIA predict the Zinc finger structure,TFIIIA three fingers lining up the major groove of DNA which sequence GCGTGGGCG,Carl Pabo obtained the structure of complex between TFIIIA and DNA using X-ray crystallography,二、起始,RNA聚合酶全酶促使局部双链解开，并催化ATP或GTP与另外一个三磷酸核苷聚合，形成第一个3,5-磷酸二酯键。,三、延长,因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿DNA链移动，按照碱基互补原则，不断聚合RNA。,四、终止,RNA转录合成的终止机制有两种：,1自动终止：模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA转录的终止。,2依赖辅助因子的终止：由终止因子(因子)识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。,第四节 真核生物RNA转录后的加工修饰,一、mRNA的转录后加工,1加帽(adding cap)：,即在mRNA的5-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即HnRNA即可进行加帽。,加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。,RNA的加工,只有成熟的mRNA才可翻译在细胞核内转录的mRNA必须加工，叫核不均一RNA,加工过程：5，端加帽子结构 3，端加polyA尾巴 切去内含子 将外显子连接起来,几种不同的帽子,帽子结构：增加RNA的稳定性提高翻译的效率由SAM进行甲基化多聚A尾巴：3，端的加尾信号AAUAAA增加RNA的稳定性，防止核酸酶的降解提高翻译的效率,2加尾(adding tail)：,这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期有关。,pre-RNA tailing,概念 A poly(A)tail(50-200)be added at-20 Nt tailing signal(AAUAAA)from 3-end of Pre-RNA,3剪接（splicing)：拼接,真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子，而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。,真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA参与构成的核蛋白体参加，通过形成套索状结构而将内含子切除掉。,自身拼接：转酯反应RNA本身可作为催化剂，可除去内含子G的帮助，内含子环化成酯分子内拼接：顺式拼接分子间拼接：反式拼接选择性拼接：机体在不同的发育时期选择不同的拼接方式，获得不同的同源蛋白。,4内部甲基化：,由甲基化酶催化，对某些碱基进行甲基化处理。,常见tRNA中的修饰核苷酸,真核生物mRNA的转录后加工修饰,二、tRNA的转录后加工,主要有以下几种加工方式：,切断。,剪接。,化学修饰。,三、rRNA的转录后加工,真核细胞,原核细胞,四膜虫前rRNA的自身剪接,RNA编辑：若基因发生了移码突变，在突变的部位增加几个U，或其他碱基纠正移码突变。由gRNA指导插入，转酯反应RNA的再编码：若RNA发生突变，校正tRNA识别密码子时搬来一个相近的氨基酸翻译移码核糖体在mRNA上的跳跃,Editing 的生物学意义,形成/删除AUG,UAA,UAG,UGA,改变codon信息,扩大编码的遗传信息量,mRNA editing 较大程度地改变了DNA的遗传信息，使该基因的DNA序列仅是一串简略意义模糊的序 列（abbreviated）或称为隐秘基因、模糊基因（cryptic gene,cryptogene）,Editing 的生物学意义？结论为时过早,中心法则的发展,