第10章 DNA生物合成课件.ppt

,第十章DNA的生物合成,中心法则(The Central Dogma)遗传信息从DNA到蛋白质的传递规律.DNA的遗传信息转录为RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质。DNA还通过复制将遗传信息代代相传。1970年发现RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。,复制 DNA的生物合成逆转录 复制（replication）：以亲代DNA为模板合成两个相同子代DNA的过程。,DNA双螺旋结构碱基配对规律,第一节 复制的特征,Parental DNA,Possible mechanisms for replication,半保留复制的实验依据(M.Meselson&F.W.Stahl,1958),一.半保留复制(semiconservative replication)复制时，亲代的双链DNA解开成两条单链，分别作为模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)为原料,按照碱基配对(AT、GC)规律与模板上的碱基配对,经依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一条与模板互补的新链,新形成的两个子代DNA分子与亲代DNA碱基序列完全相同。每个子代DNA分子中一股单链是从亲代完整地接受过来,另一股单链是新合成的,故称为半保留复制。,半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的，不是绝对的。,二.双向复制1.复制起始点(origin,ori)：多数生物体内DNA分子两条链同时复制。复制是在DNA分子的特定位点开始，称为复制起始点，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一个Ori位点，复制从起点开始，到终点结束，完 成整个DNA分子的复制,即原核生物 的DNA只有一个复制单位,为单复 制子，称为复制体。复制子：能独立完成复制的功能单位。,ori,真核生物染色体DNA有多个复制起始点。同时形成多个复制单位，从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域称复制子(replicon)，每个复制子在一个细胞分裂周期中必须起动而且只能起动一次，真核生物染色体为多复制子。,2.复制叉(replication fork)复制时，双链DNA由起始点处打开，沿两条张开的 单链模板合成DNA新链，两侧形成的Y型结构称为复制叉(replication fork)。,3.双向复制(bidirectional replication)复制是从一个起始点开始，同时向两个方向进行，称为双向复制。,三.半不连续复制,DNA双螺旋结构的两条链走向相反，复制时两条链都能作为模板合成子代DNA。DNA的新链合成只能沿53方向进行。DNA解链并开始复制后，一条新链合成方向与复制叉移动方向相同，即以35走向的亲代链为模板，因此该链可沿53方向连续合成，这条新链称为领头链。另一条链合成方向与复制叉移动方向相反，新链不能连续合成称为随从链。随从链的复制必须待模板链解链至一定长度才能进行复制，随复制叉延伸过程，可合成许多DNA片段(冈崎片段)，再经连接酶催化形成连续的新链。这种领头链连续复制，随从链不连续复制的方式称DNA复制的半不连续性。,领头链(leading strand)顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行 的，得到一条连续的子链。,随从链(lagging strand)复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。,冈崎片段(Okazaki fragment),冈崎片段：1968年日本生化学者冈崎利用电镜及放射自显影 技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，真核生物约为数百个核苷酸。,第二节DNA复制的酶学,DNA复制体系 复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程,需要多种物质的共同参与:底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；聚合酶(polymerase)：依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol或DDDP；模板(template)：解开成单链的DNA母链；引物(primer)：提供3-OH末端的寡核苷酸；其他的酶和蛋白质因子,一、DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。,(一)DNA聚合酶催化的反应1.5至3的聚合活性 催化四种dNTP一个一个地接到DNA链上去。(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应机理：,依赖于引物和模板 催化核苷酸聚合有方向性：5 3,聚合反应的特点：(1)以单链DNA为模板(2)以dNTP为原料(3)引物提供3-OH(4)聚合方向为53(5)形成3-5磷酸二酯键,2.核酸外切酶活性,35外切酶活性：切除错配的核苷酸即时校读,53外切酶活性：切除引物 切除突变的片段,？,(二)DNA聚合酶的种类1.原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol I:单一肽链的大分子，二级结构以-螺旋为主，含AR 18个-螺旋。曾被称为复制酶(replicase)含量最多功能:对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,protease,N-terminal,C-terminal,Protease,小片段（323 A.A）：具有53外切酶活性,大片段（604 A.A）：具有5 3聚合活性和35外切酶活性(Klenow 片段),是实验室常用的工具酶。,可被水解成两个片段,DNA-pol III:是E.coli的复制酶，在复制延长中真正起聚合新链作用的DNA聚合酶。由10种亚基组成的不对称二聚体：核心酶(,):3 5 外切酶活性和5 3 聚合酶活性 亚基:sliding clamp protein-复合物:识别带引物的单链DNA，促进全酶组装至模板上，稳定酶结构，增强核心酶活性。催化效率最高,2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 引物酶活性，复制起始引发DNA-pol 没有其他DNA-pol时才起作用DNA-pol 催化线粒体DNA的复制DNA-pol 复制中延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol 与原核生物的DNA-polI相似，在复制中起校读、修复和填补 缺口作用。,(三)复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3.复制中的即时校读功能。,二、解旋解链酶类解开并理顺DNA双链，维持DNA 处于单链状态。主要有解螺旋酶、DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。,(一)解螺旋酶(helicase):模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单 链，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能，解开DNA 双链。,复制相关蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC dnaX相应的表达产物蛋白质：DnaA、DnaB、DnaC DnaX Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。,(二)单链DNA结合蛋白(SSB):大肠杆菌SSB是由177个氨基酸残基组成的 同源四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷 酸单位。SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制 中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,(三)DNA拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物 体原有的性质。拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑构象的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键 可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。,拓扑异构酶I（topo I）:在原核生物曾被称为蛋白。主要作用是切开DNA双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛 状态再封闭切口。催化反应不需要ATP。,拓扑异构酶II（topo II）:在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参 与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接 断端。,三、引物酶和引发体 引物酶(primase):依赖DNA的RNA聚合酶。催化RNA引物的合成。在大肠杆菌，引物酶是dnaG基因的产物。RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3-OH末端。,引发体(primosome):是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成复合体，再结合引物酶(DnaG)形成较大的聚合体，结合到模板DNA上。复制开始时，在引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。,四、DNA连接酶（DNA ligase）连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP/NAD+。只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。若DNA两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接。,ATP,DNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。是重要的工具酶之一。,第三节DNA生物合成过程,一、原核生物DNA的生物合成（一）复制的起始1.识别复制起始点2.解开DNA双链：由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。3.形成引发体和生成引物,Genome in E.coli,E.coli 复制起始点oriC的序列特征,三组各13bp的串连重复序列（Tandem repeats）两对 9 bp反向重复序列（inverted repeats）,富含AT，是 DnaA蛋白的结合部位。,(1)DnaA辨认并结合oriC处并使此区域DNA解链。(2)DnaB在DnaC协助下解开双链并沿解链方向移动，逐渐置换DnaA，SSB结合于解开的单链DNA上。(3)引物酶DnaG进入，形成由DnaB、DnaC、DnaG和DNA起始复制区构成的引发体。,(4)引发体的蛋白质在DNA链上可以移动,消耗ATP。(5)引物酶DnaG沿53方向催化NTP聚合，合成短链RNA引物。引物长度约为十几个到几十个核苷酸不等。聚合酶催化第一个dNTP与引物3-OH生成磷酸二酯键。拓扑酶作用,使解链顺利进行。,复制的起始,大肠杆菌DNA复制的步骤,参与复制起始的各种因子,DnaA蛋白 辨认起始点解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解开DNA双链DnaC蛋白 协助解螺旋酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成SSB 稳定解开的单链拓扑异构酶 理顺DNA链oriC(245bp的DNA组分)E.coli的复制起始点,名称 功能,（二）复制的延长 在DNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的dNTP与引物或延长中的子链上3OH形成磷酸二酯键，由53方向延长子链。,半不连续复制：（1）领头链合成方向与解链方向一致,连续合成（2）随从链方向与解链方向相反,53不连续合成,同一复制叉上，领头链先于随从链复制，但两链由同一DNA-pol催化合成,（三）复制的终止,原核生物为环状DNA，双向复制，两个复制叉的汇合点就是复制的终点(termination,Ter)E.coli的复制终点(32位点)位于环形染色体和OriC相对处，有特异的 终止区序列，刚好把DNA 分成2个半圆,双向复制 进行180度后在终点汇合。,随从链不连续片段的连接 1.引物水解:前一个冈崎片段延长至后一片段时,DNA-polI 水解引物；2.填补空隙:pol利用前一个冈崎片段的3-OH,催化 dNTP聚合填补空缺；3.片段连接:DNA连接酶连接二个DNA片段，形成完整的DNA链。领头链引物水解后的空隙由环状DNA最后复制的3-OH末端延长填补并连接。复制终止后,2个子代DNA分子相互铰链在一起,在拓扑酶作用下,将其分开。,222222,2222222333333333333333333333333333333333333333322222222222222,真核生物细胞分裂的时相变化细胞周期:G1 phase:period growth of cell S phase:DNA合成期 G2 phase:cells prepare for mitosis M phase:mitosis Go phase:nondividing cells,DNA replicate periodically,二.真核生物DNA的生物合成,真核生物DNA复制的特点,真核染色质DNA结构庞大，DNA复制有多个起始点，通过许多独立复制子完成。每个复制子有固定复制起点，双向复制。各起点复制起始不同步。真核生物DNA聚合酶有DNA-pol、。DNA-pol 在复制延长中起催化作用，有解螺旋酶活性。DNA-pol 有引物酶活性。拓扑异构酶复制因子(Replication factor,RF):RFA,RFC等.增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)聚合DNA速度比原核DNA-pol慢，但总体速度不慢。随后链也是不连续合成，冈崎片段比原核细胞的短，只有数百个核苷酸。,真核生物线性染色体:多个复制起点，复制叉到达下一个起点或分子末端时即终止。,真核DNA复制的同时,组蛋白、非组蛋白同时合成,复制完成后,装配成核蛋白,组成染色体。,DNA ligase,DNA polymerase,RNase H,Remove RNA primer,Fill the gap,Join DNA fragments,DNA pol,DNA ligase,真核生物复制的终止,染色体DNA呈线性，复制在末端停止。,端粒与端粒酶 端粒(telomere)是位于真核细胞线性 染色体末端的特殊结构,由一段串联 重复的富含T、G的DNA短序列与端粒结合蛋白构成；端粒具有稳定染色体，防止末端降解和融合的功能；并维持 DNA复制的完整性。端粒DNA序列在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相 似，由长5-10bp的重复单位串联而成，人类的重复序列为 TTAGGG，长约15kb；端粒平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短,端粒DNA逐渐变短而消失,可导致染色体稳定性下降，细胞随 之衰老。,荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下）,端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白复合体，RNA分子含复制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白质部分具有逆转录酶活性。能以自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA，维持端粒的长度。人类端粒酶含三部分：端粒酶RNA(Human telomerase RNA,hTR)、端粒酶协同蛋白(Human telomerase associated protein1,hTP1)、端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTRT).除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外,大多数正常人体细胞检测不到端粒酶活性。恶性肿瘤细胞中,85%90%端粒酶强阳性。端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.,爬行模型：,端粒及端粒酶的意义：端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化(aging)及肿瘤的发生有一定关系。,第四节 逆转录和其他复制方式一.逆转录病毒和逆转录酶 逆转录(reverse transcription)以RNA为模板，dNTP为原料,在逆转录酶催化下,合成与RNA互补的DNA的过程。逆转录酶(reverse transcriptase,依赖RNA的DNA聚合酶)1.RNA指导的DNA聚合酶活性 2.RNA水解酶活性 3.DNA指导的DNA聚合酶活性,3D model of HIV reverse transcriptase,逆转录过程：,逆转录酶催化的DNA合成反应也是53方向。需要的引物是病毒本身的一种tRNA。,1.A retrovirus-specific cellular tRNA hybridizes with a complementary region called the primer-binding site(PBS).2.A DNA segment is extended from tRNA based on the sequence of the retroviral genomic RNA.3.The viral R and U5 sequences are removed by RNase H.4.First jump:DNA hybridizes with the remaining R sequence at the 3 end.5.A DNA strand is extended from the 3 end.6.Most viral RNA is removed by RNase H.7.A second DNA strand is extended from the viral RNA.8.Both tRNA and the remaining viral RNA are removed by RNase H.9.Second jump:The PBS region of the second strand hybridizes with the PBS region of the first strand.10.Extension on both DNA strands.LTR stands for long terminal repeat.,RNA病毒经逆转录成为双链DNA，能整合入宿主细胞基因组，并随宿主细胞复制和表达,可能使宿主细胞发生癌变。,A typical,minimal retrovirus consists of:1.an outer envelope which was derived from the plasma membrane of its host 2.many copies of an envelope protein embedded in the lipid bilayer of its envelope 3.a capsid;a protein shell containing 4.two molecules of RNA and 5.molecules of the enzyme reverse transcriptase,Human Immunodeficiency Virus(HIV),Reverse transcription in virus,分子生物学研究可应用逆转录酶合成DNA。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为互补DNA(complementary DNA,cDNA),cDNA,二.滚环复制和D环复制 一些简单低等生物或染色体以外的DNA复制的特殊形式。,D环复制,滚环复制,线粒体DNA为D环复制,D环复制的特点是复制起点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别,第四节 DNA损伤与修复,突变(mutation)：是指遗传物质结构改变而引起 的遗传信息的改变，也称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA 分子上碱基的改变。,一、突变的意义(一)突变是进化、分化的分子基础进化过程是突变的不断发生所造成的。没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传学家认为：没有突变就不会有遗传学。大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，叫自发突变或自然突变（spontaneous mutation）。,(二)突变导致基因型改变这种突变只有基因型的改变，而没有可察 觉的表型改变。多态性(polymophism)：是用来描述个体 之间的基因型差别现象。利用DNA多态性 分析技术，可识别个体差异和种、株间差 异。,(三)突变导致死亡突变发生在对生命至关重要的基因上，可 导致个体或细胞的死亡。(四)突变是某些疾病的发病基础包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。有 些已知其遗传缺陷所在。但大多数尚在研 究中。,二、引发突变的因素 大量的突变属自发突变，发生频率 为10-9。用生活环境中导致突变的因素，在实 验室可以诱发突变，称为诱变，导致 突变的因素称为诱变剂。主要有物理 和化学因素。,物理因素：紫外线和各种辐射,二聚体的形成影响了DNA的双螺旋结构,使复制和转录受阻,化学因素：常见的化学诱变剂,Ames assay,His-Salmonella,HistidineDeficientplates,Control plate,Plate+chemical,Benefits:two-day assay;very cheap,Ames实验是检验致癌剂的常用方法，将鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸营养缺陷型菌株接种到含待测物的无组氨酸培养基平皿中，若待测物含有诱变剂，可发生回复突变，长出的菌落多少可以反映诱变剂的强弱。,Ames assay,Relies on the high correlation between carcinogenesis and the DNA-damaging,or mutagenic agents;Uses a disabled Salmonella Typhimurium,with defective cell wall,allowing easy import of chemicals;His-;with defective repairing system;Look for reverse mutations(回复突变)in genes for Histidine biosynthesisMutant genes will allow survival and growth of the bacteria on histidine deficient platesA major shortfall of Ames test is that it uses bacteria,instead of eukaryotic cells.,Ames assay,Ames test detects direct acting mutagensSome chemicals are mutagenic,but not carcinogenicMany chemicals are carcinogenic,but not mutagenic,三、突变的类型(一)错配（点突变）指DNA分子上一个碱基的变异（置换）。1.转换(transition)：发生在同型碱基之间的置换 嘌呤 嘌呤 嘧啶 嘧啶2.颠换(transversion)：发生在异型碱基之间的置换 嘌呤 嘧啶,镰形红细胞贫血病人的Hb(HbS)与正常成人的Hb(HbA)比较,(二)缺失(deletion)和插入(insertion)1.缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA 大分子上缺失2.插入：DNA大分子上插入一个碱基或一 段核苷酸链,框移突变(frame-shift mutation):缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。通常使基因产物完全失活，出现终止码会使翻译提前终止。正常5 GCA GUA CAU GUC 丙 缬 组 缬 缺失C 5 GAG UAC AUG UC 谷 酪 蛋 丝,(三)重排(rearrangement)DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,四、DNA损伤的修复 修复(repairing)：是指针对已发生的缺陷而 进行的补救机制。,修复的主要类型,光修复切除修复重组修复SOS修复,DNA damage resulting in multiple broken chromosomes,DNA ligase,(一)光修复(light repairing),光修复酶,（二）切除修复(excision repairing),是细胞内最重要和有效的修复机制,E.coli 的切除修复机制,首先，UvrA与UvrB结合成一个UvrAB，它可以识别嘌呤二聚体和其他一些较大的病变区。之后，UvrA与UvrB分离（需ATP参与），UvrC与Uv-rB结合。UvrBC结合体从被损坏链的5端切割掉7个核苷酸，从3端切割掉3-4个核苷酸，这一过程也需要ATP参与。UvrD是一个解旋酶，它促使DN-A双链解开，从而将被切掉的单链从两切点间去除。将损坏链去除的酶可能是DNA合成酶I。,In E.coli,proteins UvrA,UvrB,and UvrC are involved in removing the damaged nucleotides(e.g.,the dimer induced by UV light).The gap is then filled by DNA polymerase I and DNA ligase.,DNA损伤较大时,损伤部位不能指导子链合成,子链出现缺口；重组蛋白RecA将另一股健康母链相应部位与缺口部分进行交换，以填补缺口；在DNA聚合酶、连接酶作用下,可以补平健康母链,而损伤仍留在 已复制完成的双链上。通过不断复制使损伤DNA链所占比例不 断减低。,（三）重组修复,重组修复(recombination repairing),(四)SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时，应急而诱发产生的一系列复杂的修复反应。激活多种参与应激修复的酶和蛋白质因子。在E.coli，各种与修复有关的基因，包括lexA、rec类、uvr类等组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复为应急性修复方式，特异性低，对碱基的识别、选择能力差，错配高。通过SOS修复，复制如能继续，细胞可存活。然而DNA保留的错误较多，会引起较广泛、长期的突变。,