第十章核苷酸代谢及核酸的生物合成课件.ppt

2023年4月2日星期日,1,第十章 核苷酸代谢及核酸的生物合成,2023年4月2日星期日,2,一、核酸的酶促降解,1、核酸水解：,DNA 稳定，耐酸碱RNA 易水解：碱水解,2、酶促水解：,1）降解方式,2023年4月2日星期日,3,RNA:RNase（稳定、耐高温）,DNA:DNase（种类多、工具酶）,2）核酸E,（1）底物：,2023年4月2日星期日,4,（2）作用方式：,核酸外切E：核酸链的一端逐个水解下核苷酸的酶（非特异性）,3-核酸外切E：蛇毒磷酸二酯E3OH端开始，生成5-核苷酸,5-核酸外切E：牛脾磷酸二酯E5OH端开始，生成3-核苷酸,2023年4月2日星期日,5,特异水解分子内磷酸二酯键的酶(特异性强),核酸内切E,牛胰核糖核酸酶：嘧啶核苷3磷酸与相邻核苷酸的3，5磷酸二酯键,2023年4月2日星期日,6,2023年4月2日星期日,7,限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶,能识别水解外源双链DNA的核酸内切酶（细菌）,细菌本身DNA，顺序已被甲基化，不被水解仅限于水解外源DNA以保护自身限制性酶,2023年4月2日星期日,8,限制酶：内切方式水解DNA,产物：5为P，3为OH,特点：极高的专一性（对特定核苷酸顺序专一性，非碱基专一）对底物DNA有特异的识别位点 位点一般在48bp，通常具回文结构 切割后形成粘性末端（或平齐末端）,2023年4月2日星期日,9,回文结构：DNA局部双螺旋以某一对称轴旋转180后，与另 一侧的互补片段的顺序完全相同的DNA结构,粘性末端：双链DNA分子经限制性E作用后，每条单链的一端 带有识别顺序中几个互补碱基，这样的末端称,2023年4月2日星期日,10,（3）核酸的酶促降解,2023年4月2日星期日,11,核酸,核苷,碱基,降解,核苷酸,Pi,戊糖,2023年4月2日星期日,12,（5）核苷酸生理功能：,1）合成核酸的原料：ATP，GTP，CTP，UTPRNA dATP，dGTP，dCTP，dTTPDNA,2）能量的贮存和供应：ATP，GTP，UTP，CTP等,3）参与代谢、调节生理活动：cAMP、cGMP：激素的第二信使,4）构成酶的辅酶或辅基：NAD+，NADP+，FAD，FMN，CoA：含核苷酸,5）代谢中间物的载体：UDP-糖基，CDP-胆碱、胆胺、甘油二酯，腺苷-蛋氨酸,2023年4月2日星期日,13,二、核苷酸的降解,2023年4月2日星期日,14,1、嘌呤的降解,2023年4月2日星期日,15,次黄嘌呤,尿素,NH3+CO2,G,RNH2,（微生物）,黄嘌呤,尿酸,尿囊素,鸟类,2023年4月2日星期日,16,尿酸：人体分解代谢的终产物痛风症：嘌呤核苷酸分解代谢异常 血中尿酸水平升高 尿酸钠晶体沉积，软骨、关节、软组织、肾脏 临床：皮下结节，关节疼痛等,2023年4月2日星期日,17,2、嘧啶的降解,2023年4月2日星期日,18,NH2,二氢尿嘧啶,还原,H2O,（开环）,脲基丙酸,H2O,丙AA,2023年4月2日星期日,19,三、核苷酸的合成代谢,原料：氨基酸、甲酸盐和CO2等,从头合成(de vovo synthesis),利用核酸降解的中间产物或外源的核苷,嘌呤碱和嘧啶碱合成新的核苷酸,补救途径(salvage pathway),2023年4月2日星期日,20,嘌呤、嘧啶,基本途径,从头合成肝,半合成（补救合成）脑、骨髓,2023年4月2日星期日,21,核糖核苷酸的合成,2023年4月2日星期日,22,核苷酸合成的两条途径,核糖、氨基酸、CO2、NH3,核糖核苷酸,脱氧核苷酸,辅酶,RNA,核苷,碱基,脱氧核苷,DNA,补救途径 从头合成,肝,半合成,脑、骨髓,2023年4月2日星期日,23,（一）嘌呤核苷酸的从头合成,1、嘌呤核苷酸环上原子来源,CO2,Asp,一碳单位,Gln,甘氨酸,一碳单位,N5,N10-次甲基四氢叶酸,2023年4月2日星期日,24,一碳单位,一碳单位,2023年4月2日星期日,25,2、合成特点,合成部位：胞浆主要器官：肝脏；其次，小肠和胸腺 脑和骨髓不能合成5-磷酸核糖IMP（次黄苷酸）AMP、GMP,2023年4月2日星期日,26,IMP合成：5-P-核糖+ATPPRPP（5-磷酸核糖焦磷酸）逐渐加上嘌呤的各个原子先形成右环，再左环（共11步反应）四氢叶酸（FH4）：一碳单位的载体,2023年4月2日星期日,27,2023年4月2日星期日,28,IMP的合成,2023年4月2日星期日,29,3、嘌呤核苷酸的相互转化,黄苷单磷酸,腺苷单磷酸,鸟苷单磷酸,次黄苷酸,2023年4月2日星期日,30,NMP+ATP,NDP+ADP,NDP+ATP,NTP+ADP,磷酸激酶,N：嘌呤或嘧啶碱基,2023年4月2日星期日,31,嘌呤类似物（6-巯基嘌呤）：抑制AMP、GMP的生成 谷胺酰胺类似物（氮杂丝氨酸）：抑制IMP的合成中有谷胺酰胺参与的反应 叶酸类似物（氨基蝶呤、氨甲喋呤）：抑制IMP合成中有四氢叶酸参与的反应,4、临床抗癌药物的作用机理,2023年4月2日星期日,32,氨甲酰磷酸,天冬氨酸,（二）嘧啶类核苷酸的从头合成,1、嘧啶环上原子来源,前体：氨甲酰磷酸和天冬氨酸,2023年4月2日星期日,33,合成场所：胞浆（肝细胞）氨甲酰磷酸+天冬氨酸嘧啶环+PRPPUMP 关键中间产物：乳清酸 胞苷酸：尿苷酸转变,2、合成特点,2023年4月2日星期日,34,2023年4月2日星期日,35,2023年4月2日星期日,36,2023年4月2日星期日,37,3、嘧啶核苷酸的合成与相互转变,2023年4月2日星期日,38,除脱氧胸苷酸，大多数合成是在NDP的基础上进行,（三）脱氧核糖核苷酸的合成,1、核糖核苷酸的还原,2023年4月2日星期日,39,2、dTMP 的合成,2023年4月2日星期日,40,(四)NMPNDP、NTP,生物合成和能量转换中，核苷酸的活泼形式是NDP和NTP,2023年4月2日星期日,41,2023年4月2日星期日,42,脱氧胸苷酸的合成,2023年4月2日星期日,43,氟尿嘧啶(FU),氨基蝶呤氨甲蝶呤,胸苷酸合成的抗代谢物作用机理,2023年4月2日星期日,44,5氟尿嘧啶,氨甲蝶呤,嘧啶类抗代谢物结构,2023年4月2日星期日,45,各种核苷酸合成的相互关系,2023年4月2日星期日,46,磷酸核糖转移酶 途径:主要途径 嘌呤+PRPP 嘌呤核苷酸+PPi,（四）嘌呤核苷酸合成的补救途径,2023年4月2日星期日,47,2023年4月2日星期日,48,磷酸核糖转移酶缺乏与Lesch-Nyhan综合症HGPRT（次黄嘌呤尿嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏23岁，患儿，咬手指和嘴唇，智力缺陷，常痉挛，痛风，活20岁左右不能进行补救途径，从头合成速度加快尿酸积累 结石，痛风 自残（？）,2023年4月2日星期日,49,（五）嘧啶核苷酸合成的补救途径,2023年4月2日星期日,50,四.DNA生物合成,（一）分子遗传的中心法则,DNA是遗传信息的储存和发布者，在遗传信息的传递中处于中心地位,1958年，Crick，“中心法则”（Central dogma),2023年4月2日星期日,51,生物的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子上（特定的核苷酸排列顺序）细胞分裂，DNA复制，遗传信息子代细胞。子代细胞生长发育遗传信息（转录）RNA氨基酸顺序（翻译）蛋白质执行多样的生物学功能后代表现出与亲代极为相似的遗传特征,2023年4月2日星期日,52,2023年4月2日星期日,53,复制 Replication：以DNA双链为模板，按照碱基配对原则，合成出与亲代DNA分子相同的两个双链DNA分子的过程,基本概念,转录（Transcription)：以DNA为模板，按照碱基配对原则，合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程,2023年4月2日星期日,54,逆转录（Reverse Transcription)：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成DNA的过程,翻译（Translation)：以mRNA为模板，合成出具有特定AA顺序的Pr肽链的过程,2023年4月2日星期日,55,中心法则（Central Dogma)：说明DNA、RNA和蛋白质之间信息传递关系的法则即：,遗传信息：决定生物结构、性状和代谢类型的特殊的生物指令,2023年4月2日星期日,56,（二）DNA的复制,1、DNA生物合成的机理,2023年4月2日星期日,57,2、DNA复制的基本规律,1）半保留复制(semi-conservative Replication),DNA复制过程中，新形成的DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式,生物学意义：生物的遗传特性，保持相对稳定性,2023年4月2日星期日,58,2023年4月2日星期日,59,2023年4月2日星期日,60,2）复制的多模式,特定的部位开始，双向或单向进行原核生物（细菌、病毒）：一个起点；双向为主，也有单向（某些质粒、病毒）真核生物：多个起点；双向为主，也有单向（细胞器DNA）,2023年4月2日星期日,61,开始DNA复制的特定位点原点(origin)。从原点开始同时向DNA链两个方向进行，形成一个分叉，复制叉(replieationfork)。复制叉在电镜下观察犹如一只眼睛复制眼(replication eye)。环形DNA复制时由于复制眼的形成，构成了一个有内圈的闭合环状体Q结构。,2023年4月2日星期日,62,2023年4月2日星期日,63,2023年4月2日星期日,64,Meselson、Stahl 15N标记，15NH4Cl，E.coli培养基，培养12代 15N的标记DNA 14N的普通培养基 四代DNA，氯化铯密度梯度离心,实验依据,2023年4月2日星期日,65,2023年4月2日星期日,66,（二）DNA复制的起点和方向,1、两个起点，两个生长端的相向复制 线性DNA病毒 DNA每条链有1个复制起点，分别合成1条新DNA，两条新链相向合成，每个生长点只有1条链合成2、1个起点，1个复制区的单向复制 环形DNA 两条链的复制起始点在同一位置，复制向一个方向运动，两条DNA链均被复制3、1个起点，两个复制区的双向复制 普遍 复制起始于1个位点，形成两个复制区向相反方向运动，在每个复制区两条DNA链均被复制,2023年4月2日星期日,67,DNA复制的起点和方向示意图,2023年4月2日星期日,68,3）复制需RNA为引物,4）子链DNA延伸方向：,核糖的3-OH能与其它核苷酸的磷酸以3，5-磷酸二酯键相连,2023年4月2日星期日,69,5）半不连续复制(semi-discontinuous replication),冈崎片段原核生物：10002000核苷酸真核生物：100200核苷酸,2023年4月2日星期日,70,前导链（leading strand）：以35的亲代链为模板，子代链能连续合成，称。滞后链（lagging strand）：以53的亲代链为模板，子代链不能连续合成，称,2023年4月2日星期日,71,冈崎片段（Okazaki fragment)：1968年，冈崎 以53的亲代链为模板合成新链时，先形成一些1000核苷酸左右的DNA短片段，然后由连接E连接成完整的子链。在复制过程中形成的DNA片段，称为,2023年4月2日星期日,72,半不连续复制：新生的DNA双链，一条链按53的方向连续合成，另一条则按53的方向不连续合成,2023年4月2日星期日,73,3、DNA复制中所需的酶和辅因子,1）引物酶(Primase）,功能：以DNA为模板，以NTP为原料，合成一小段RNA，作为合成DNA 的引物（Primer）,DNA聚合酶，按模板链的指令引物3OH端延伸无从头合成的活性。引物E 与有关蛋白质结合成引发体（primosome),2023年4月2日星期日,74,2）DNA聚合酶E.coli：,（1）DNA聚合酶(109kD),1958年，A.Kornberg，E.coli,功能：校读错误，填补空隙，切除引物,2023年4月2日星期日,75,（2）DNA聚合酶和,DNA聚合酶：DNA的损伤修复53聚合活力35外切活力,DNA聚合酶：复制的主要酶53聚合活力35外切活力53外切活力,分子量约140kD，10种亚基组成的不对称二聚体。,2023年4月2日星期日,76,2）DNA聚合酶 E.coli：,2023年4月2日星期日,77,真核细胞的DNA聚合E,、：复制延长：修复（没有其他酶时发挥作用）（线粒体）：线粒体DNA的复制？：校读、修复和填补空缺,2023年4月2日星期日,78,功能：双螺旋解链需ATP供能,3）DNA连接E（DNA ligase),功能：缝合缺口不连接单独存在的DNA或RNA单链,4）DNA解螺旋E（helicase),基因工程：工具酶,2023年4月2日星期日,79,功能：稳定解开的DNA单链阻止复性保护单链不被核酸E降解,5）单链结合蛋白（single-strand binding protein，SSB）,2023年4月2日星期日,80,6）拓扑异构酶（topoisomerase),转录,复制,2023年4月2日星期日,81,型E：双链DNA的一条链发生断裂和再连接，减少负超螺旋反应不需供能活性转录区，同转录有关,2023年4月2日星期日,82,型E（旋转E，grase）：内切E、连接E活力使DNA双链同时发生断裂和再连接连续引入负超螺旋（需ATP供能）同复制有关,2023年4月2日星期日,83,2023年4月2日星期日,84,4、原核生物DNA的复制过程（E,coli）,1）DNA复制的起始起始位点识别DNA解链RNA引物合成,2023年4月2日星期日,85,参与复制起始的各种蛋白质,2023年4月2日星期日,86,复制：一个特定位点（oriC)开始另一特定位点(ter)终止能独立进行复制的单位复制子(replicon)原核生物：一个复制子，真核生物：多个复制子,2023年4月2日星期日,87,DNA B蛋白：识别起始位点，ATP供能、组装引发体 与模板起始部位结合解链酶（rep蛋白）、旋转酶共同作用，双链局部解开 暴露出起始位点单链结合蛋白(SSB)与DNA结合：防止H键的形成 电镜观察：”眼睛”复制眼”继续解链形成复制叉引物酶（DnaG)催化下合成一小段RNA，5-3P，3-OH,2023年4月2日星期日,88,2023年4月2日星期日,89,复制叉,2023年4月2日星期日,90,2023年4月2日星期日,91,（前导链）,（滞后链）,冈崎片断,半不连续复制,DNA双链:反向平行合成方向：53DNA复制：合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制前导链；另一条链的合成方向和复制叉的前进方向相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成滞后链滞后链的片段冈崎片段，合成后再连接,2023年4月2日星期日,92,模板：DNA 引物：RNA 原料、能源：NTP，dNTP 酶：引物酶；DNA聚合酶I、II、III；DNA连接酶；解链酶；单链结合蛋白；拓扑异构酶 合成方向：模板链：35 合成链：53,原核细胞DNA的复制（E.Coli）,2023年4月2日星期日,93,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,2023年4月2日星期日,94,DNA聚合酶催化的反应：,2023年4月2日星期日,95,与DNA合成有关的蛋白因子（E.coli）,2023年4月2日星期日,96,DNA合成步骤,解旋：拓扑异构酶解链：解链酶，SSB结合单链，防止氢键再形成识别起点：引物酶生成引物：DNA为模板，引物酶催化，DNA转录DNA的生成：RNA引物3末端 碱基互补，DNA，聚合酶催化,2023年4月2日星期日,97,DNA合成的起始与延伸,2023年4月2日星期日,98,拓扑异构酶I的作用,2023年4月2日星期日,99,拓扑异构酶II的作用,2023年4月2日星期日,100,切除引物：DNA聚合酶I，冈崎片段补齐封口：DNA聚合酶I，碱基互补，填补冈崎片段间的缺口 DNA连结酶，连结 模板链新的互补链 NAD+供能,2023年4月2日星期日,101,引物的切除，缺口填补，切口连接,2023年4月2日星期日,102,真核细胞DNA的复制（与原核细胞的区别）,2023年4月2日星期日,103,RNA引物、冈崎片段较小 复制速度较慢（组蛋白的存在，DNA双股稳定）多起点 DNA聚合酶，、线粒体聚合酶 催化聚合，无外切酶作用,2023年4月2日星期日,104,DNA聚合酶的功能,2023年4月2日星期日,105,（三）逆转录,（reverse transcription),以RNA为模板合成DNA的过程,逆转录E广泛存在于致癌RNA病毒、正常动物的胚胎细胞,2023年4月2日星期日,106,2023年4月2日星期日,107,因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家,2023年4月2日星期日,108,（四）DNA复制的忠实性,高度精确性，错误率约1/1091/1010,1、碱基的配对规律：配错几率 1/1041/105。2、DNA聚合酶的校对功能：错配几率降低1001000倍3、DNA的损伤修复系统,2023年4月2日星期日,109,DNA聚合酶的的自我校正 DNA 聚合酶不能从头合成DNA，即不能把两个dNTP连接起来，而只能将一个个核苷酸单位加到形成碱基配对的引物链3羟基上，如果引物链3羟基出现了和模板链错配的碱基，DNA聚合酶就会立即停止前进，并利用35核酸外切酶活性将错配的核苷酸从引物3端切除，只有引物3端重新出现碱基配对时才继续合成DNA。所以在合成DNA之前必须有正确的碱基配对存在于3端，即DNA聚合酶必须利用RNA引物链来检验3端的碱基配对正确与否，在确认无误后才开始合成。,2023年4月2日星期日,110,错配校正系统 错配校正系统能发现DNA双螺旋因非互补碱基对间的不对称而产生的变形，它能区分和切除存在于新合成的DNA中错配的核苷酸。E.coli的错配校正系统利用dam基因编码的甲基化酶将DNA碱基序列中的A在N6位甲基化，但新合成的A要晚一些才被甲基化，这使碱基序列只是在刚合成的新DNA链中还没有被甲基化，这就能区别新DNA链和模板链。,参与错配修复的酶与蛋白质：Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶;DNA聚合酶;外切酶、；RecJ核酸酶DNA连接酶；SSB,2023年4月2日星期日,111,错配校正示意图,2023年4月2日星期日,112,五、DNA的突变（损伤）和修复,DNA的碱基顺序发生稳定而突然的变化，导致DNA的复制、转录和翻译发生变化，表现出异常的遗传特性,（一）DNA的突变（基因突变）：,自发突变和诱发突变,2023年4月2日星期日,113,环境因素,电离辐射 紫外线 烷化剂 脱氨剂等,2023年4月2日星期日,114,（二）突变的形式：,1、置换：一个or几个碱基的置换（可逆）a、转换：G-A，C-T互变；b、颠换：嘌呤-嘧啶互变,2023年4月2日星期日,115,2023年4月2日星期日,116,2、插入：插入一个or几个碱基（可逆），导致遗传密码 解读框架的改变，突变点后的密码都可能发生 错误移码突变(frameshift mutation)溴化乙锭,2023年4月2日星期日,117,3、缺失：缺失一个or几个碱基对(不可逆),2023年4月2日星期日,118,（三）DNA的损伤修复,DNA损伤，死亡修复机制，能够修复一定程度的DNA损伤但仍有可能发生突变,2023年4月2日星期日,119,紫外线照射相邻两个碱基间形成共价键二聚体（TT、TC）二聚体阻碍DNA聚合酶的作用复制不能继续,1、光复活（photo reactivation),紫外照射损伤，强的可见光(400nm)照射，大部分损伤的细胞修复光复活,2023年4月2日星期日,120,机制,可见光,激活,光复活酶、光裂合酶,嘧啶二聚体,分解,哺乳动物细胞缺乏,2023年4月2日星期日,121,光复活酶,2023年4月2日星期日,122,2、切除修复（暗修复，excision repair),各类生物,2023年4月2日星期日,123,3、重组修复（recombination repair),2023年4月2日星期日,124,（a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸,（b）无碱基核酸内切酶在无碱基酸处切开产生切口。,（c）DNA聚合酶将无碱基酸切除并填补缺口。,（d）DNA连接酶连接切口。,碱基切除修复,2023年4月2日星期日,125,核苷酸切除修复 这种方式可以修复DNA发生的几乎所有类型的巨大损伤，包括某些与致癌剂共价结合的碱基,2023年4月2日星期日,126,受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。,重组修复,2023年4月2日星期日,127,4、SOS修复（紧急修复）（error prone repair),细胞DNA损伤或复制系统受抑制，紧急情况 诱导产生和增加切除修复和重组修复的关键E和蛋白质 加强修复能力 诱导产生DNA聚合E（缺乏校对功能）随机聚合核苷酸 避免死亡，却带来高突变率的修复过程,2023年4月2日星期日,128,六、RNA的生物合成,（一）转录,在DNA指导下的RNA合成,2023年4月2日星期日,129,不对称转录,转录方式：,转录过程中，DNA双链只有一条链作为模板指导RNA的合成的转录方式,模板链,转录过程中指导RNA合成的DNA链。无意义链、负链,与模板链对应的DNA链编码链。有意义链、正链,2023年4月2日星期日,130,启动子（promoter),终止子(terminator),模板链（templatte strand）,有意义链(sense strand),非信息区,DNA,5,5,3,3,2023年4月2日星期日,131,（二）RNA聚合E,1、原核生物RNA聚合E(2）,：全酶滑动，决定哪些基因转录：转录，催化核苷酸形成磷酸二酯键，延长RNA：结合模板DNA：识别转录起始位点,转录产物：mRNA、rRNA前体和tRNA前体,2023年4月2日星期日,132,2、真核生物RNA聚合E,814个亚基组成，含Zn2+寡聚E，转录不同RNA,2023年4月2日星期日,133,（三）转录的模板,模板DNA与转录有关的结构：,模板DNA，由RNA聚合E识别、结合并确定转录起点的特定序列,启动子（promotor)：,终止子（terminator）：,模板DNA5端的转录终止信号,2023年4月2日星期日,134,1、原核生物的启动子,4060bp,2023年4月2日星期日,135,2、原核生物转录终止类型,1）不依赖因子的终止：,富含GC的反向重复转录的RNA，发夹转录终止,含富GC的回文序列和寡聚U序列,2023年4月2日星期日,136,2）依赖因子的终止：,模板终止信号,连续6个U,2023年4月2日星期日,137,2023年4月2日星期日,138,1960年，RNA 聚合酶被发现E.coli，RNA 聚合酶催化RNA的合成需要：模板：双链或单链 DNA活性单体物质：四种NTP二价金属离子：Mg2+或Mn2+，在生物体中(in vivo）发现的是Mg2+合成方向：5 3,2023年4月2日星期日,139,RNA的合成与DNA合成的区别,转录不需要引物只转录DNA 分子中的一个片段（操纵子operon)双链DNA只有一条链具有转录活性（模板链）RNA聚合酶无校对功能,2023年4月2日星期日,140,启动子（promoter),终止子(terminator),模板链（templatte strand）反意义链(antisense strand),有意义链(sense strand),非信息区,DNA,5,5,3,3,模板链：双链DNA中具有转录活性的的链模板链，反义链（或负链）编码链：双链DNA中无转录活性的链编码链，有义链（或正链）。,DNA的有义链和反义链,2023年4月2日星期日,141,由5种亚基2组成全酶；没有、亚基的酶称为核心酶，只催化链的延长；称为起始因子，能识别DNA链的转录起始信号（称为启动子）,E.Coli中的RNA聚合酶,2023年4月2日星期日,142,（四）RNA转录过程（E.coli）,1、转录的起始：,因子识别启动子,酶与模板结合，DNA局部解链,启动RNA的合成,因子脱落，核心酶滑动,2023年4月2日星期日,143,RNA转录起始,2023年4月2日星期日,144,解螺旋,恢复螺旋,转录泡,模板链,编码链,RNA聚合酶作用示意图,2023年4月2日星期日,145,2、转录的延伸：,核心酶沿模板3 5滑动根据模板指令选择相应的NTP加入RNA链沿5 3方向延伸,2023年4月2日星期日,146,核心酶沿模板35滑行至终止信号区域，转录终止,3、转录的终止：,2023年4月2日星期日,147,2023年4月2日星期日,148,（五）DNA复制与RNA转录的异同点,2023年4月2日星期日,149,（六）转录产物的加工,1、真核生物mRNA的转录后加工,原核生物：不需加工,2023年4月2日星期日,150,hnRNA：mRNA前体，外显子、内含子 分子量大而不均一核不均一RNA。内含子：真核基因内部间隔外显子，并从mRNA上消失的DNA序列外显子：真核基因中在mRNA上出现，编码蛋白质的DNA序列,2023年4月2日星期日,151,内含子,外显子,真核mRNA前体的加工,2023年4月2日星期日,152,2、tRNA前体的加工,数十种tRNA加工不同,1）切除5、3末端部分核苷酸2）3末端加上CCA-OH序列3）核苷的修饰：甲基化,2023年4月2日星期日,153,3、rRNA前体的加工,2023年4月2日星期日,154,原核生物rRNA转录前体的加工,甲基化,核酸内切酶,核酸外切酶,2023年4月2日星期日,155,真核生物rRNA转录前体的加工,核酸外切酶,甲基化,核酸内切酶和外切酶,2023年4月2日星期日,156,基因工程简介,END,2023年4月2日星期日,157,（1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。,（2）3端添加polyA“尾巴”；,（3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；,（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,真核mRNA前体的加工,2023年4月2日星期日,158,内含子,外显子,真核mRNA前体的加工,2023年4月2日星期日,159,因发现断裂基因而获1993年诺贝尔生理学奖的Richard J Robert and Phllip A Sharp,2023年4月2日星期日,160,概念：RNA病毒以自身RNA为模板合成与自身RNA完全相同RNA分子的过程称为RNA的复制。,（二）RNA指导的RNA合成（RNA复制）,2023年4月2日星期日,161,（2）复制酶的亚基与来自宿主细胞的亚基自 动装配成RNA复制酶，进行RNA复制，通常以分子中 单链RNA为模板（正链），复制出一条新的RNA链（负链），然后以负链为模板复制出大量正链，再 与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。,两个阶段:,（1）病毒RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的亚基。,2023年4月2日星期日,162,RNA复制酶的催化性质:,以四种NTP为底物；专一性地选择病毒RNA为模板；按5 3的方向合成病毒RNA；无外切酶活性（即无校对功能）。,2023年4月2日星期日,163,病毒RNA的复制方式,1、病毒含正链RNA：进入宿主细胞后先进行病毒RNA复制酶和有关病毒蛋白质的合成（借助于宿主细胞的蛋白质合成体系），然后进行RNA的复制，再装配病毒颗粒。如：噬菌体Q和灰质炎病毒。2、病毒含负链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，先进行RNA的复制合成正链RNA，再以正链RNA为模板合成病毒蛋白质RNA，然后装配病毒颗粒。如：狂犬病病毒、马水苞性口炎病毒。3、病毒含双链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，以双链RNA为模板，通过不对称复制产生正链RNA，并以正链RNA为模板合成病毒蛋白质，然后再合成负链RNA并形成双链RNA，再装配病毒颗粒。如呼肠病毒。4、致癌RNA病毒：,2023年4月2日星期日,164,七、核酸生物合成与病毒致癌,核酸生物合成的一般规则,绝大多数细胞DNA和RNA的合成，都是按照Watson-Crick 碱基互补的原则,通过拷贝预先存在的DNA链（模板链）来产生的。核酸链的合成方向只有一个：53。特异的聚合酶催化合成DNA或RNA。致癌的DNA与RNA病毒的繁殖与致癌作用是核酸生物合成的具体化。,2023年4月2日星期日,165,正常细胞受到DNA肿瘤病毒感染后，发生染色体变异、永久性的形态改变、失去接触抑制、增殖加速、产生新的抗原从而具有形成肿瘤的能力。DNA病毒吸附于宿主的细胞膜而进入细胞后，在细胞膜处脱去核壳蛋白，DNA 进入细胞核中。其一部分或全部可整合于宿主细胞核的DNA分子中，形成变异的DNA。整合后的DNA可以完整分子的形式一起复制，转录。它使宿主细胞发生某些特征性改变，最终转化成肿瘤细胞。,DNA病毒,2023年4月2日星期日,166,RNA病毒不含DNA，绝大多数病毒RNA是单链的，而且都是线状分子。RNA病毒中，RNA是其遗传信息的携带者，通过RNA的复制，传递遗传信息。通常病毒RNA复制过程包括:基因组RNA转录为mRNA，mRNA翻译为病毒特异性蛋白质，基因组RNA复制和病毒装配与释放。病毒mRNA的合成在病毒复制过程中处于核心地位。根据病毒粒子的RNA和指导病毒蛋白质合成的mRNA之间关系，把RNA病毒分为：正链RNA病毒、负链RNA病毒、双链RNA病毒、逆转录病毒。,RNA病毒,2023年4月2日星期日,167,RNA 病毒粒子中存在有反转录酶，在其催化下，可以病毒RNA为模板合成DNA。此外，RNA肿瘤病毒在具有一定致癌作用的酶的催化下，可将致癌信息整合到宿主细胞染色体的DNA分子中去，完成致癌过程。病毒RNA不能直接复制RNA，须先经反转录酶将RNA的遗传信息转至DNA形成DNA前病毒，然后再在DNA指导的RNA聚合酶的作用下，完成RNA病毒核酸的转录。,2023年4月2日星期日,168,左图是一些病毒的例子：,2023年4月2日星期日,169,八、核酸生物合成的抑制剂,不少药物对核酸的合成有抑制作用，或通过抑制核苷酸的合成，间接影响核酸合成，或抑制核酸合成。核酸合成受抑制，也将影响蛋白质的合成。,2023年4月2日星期日,170,一些在结构上与核苷酸合成代谢的中间产物或参与者相似的化合物，即所谓的“抗代谢物”，对于正常的核苷酸合成有对抗作用。1)氨基酸类似物，如谷氨酰胺的类似物氮杂丝氨酸,6-重氮基-5-氧正亮氨酸。2)叶酸类似物，如四氢叶酸(FH4)类似物氨呤及氨甲基蝶呤。3)嘌呤、嘧啶类似物，如 6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶等。,核苷酸合成的抑制剂,2023年4月2日星期日,171,有一些化合物由于能够与DNA结合，使DNA失去模板功能，从而抑制其复制与转录。某些重要的抗癌药和抗病毒药就属于这一类。1)硫芥、氮芥等烷化剂能干扰DNA的复制。2)丝裂霉素G，能专一地抑制 DNA复制,但不影响RNA和蛋白质合成。3)放线菌素D，低浓度就可有效地 抑制DNA转录功能，高浓度能抑制 DNA复制功能。,DNA模板功能的抑制物,2023年4月2日星期日,172,利福霉素及利福平不作用于DNA，而是抑制细菌的RNA聚合酶和反转录酶。膦羧基乙酸主要抑制病毒的DNA聚合酶，实验证明，它在低浓度时就可选择性地抑制病毒DNA合成，而对宿主细胞须在较高浓度时才有一定的抑制作用。,核酸聚合酶的抑制物,2023年4月2日星期日,173,生 物 化 学 实 验,氨基酸的纸层析,常用的层析方法:,纸层析柱层析薄板层析,吸附层析分配层析离子交换层析,2023年4月2日星期日,174,Rf,迁移率移动速率,原点到层析点中心的距离,原点到溶剂前沿的距离,Gly、Phe、His,水：固定相有机溶剂：流动相,2023年4月2日星期日,175,2023年4月2日星期日,176,琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白,琼脂糖浓度:0.5%凝胶厚度:1.52mm,影响蛋白迁移速度主要因素:蛋白质等电点溶液pH值溶液离子强度电场强度,2023年4月2日星期日,177,+,-,前,1,2,3,乳糜微粒,2023年4月2日星期日,178,蛋白质固定：变性，易于染色,溶液pHpI：蛋白质带负电荷，向阳极移动溶液pHpI：蛋白质带正电荷，向阴极移动如果电泳缓冲体系的pH被分离蛋白pI点样处靠近阴极,2023年4月2日星期日,179,醋酸纤维薄膜电泳：电荷效应,聚丙烯酰胺凝胶电泳：浓缩效应 分子筛效应 电荷效应,琼脂糖凝胶电泳：电荷效应 浓缩效应,2023年4月2日星期日,180,小麦萌发前后淀粉酶活力的比较,酶的分离纯化:提取温度010(低温)淀粉酶活力测定温度:终止淀粉水解:,酶的活力单位：指在一定的条件下，底物的减少量或产物 的增加量,2023年4月2日星期日,181,CTAB分离缓冲液,DNA 的提取和含量测定,Tris-HCINaClEDTACTAB巯基乙醇,测定核酸含量的方法,紫外吸收法二苯胺法定磷法,2023年4月2日星期日,182,DNA：水、高浓度盐中溶解性大，低盐（0.14M）溶解 度低RNA：高盐溶解性小。,沉淀DNA：异丙醇、乙醇等有机溶剂,2023年4月2日星期日,183,核酸测定：OD260/OD280,RNA：2.0,物质内含杂蛋白较多时，OD260/OD280 下降,DNA：1.8,蛋白质：1.8（OD280/OD260）,2023年4月2日星期日,184,VC的测定,氧化型2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色 碱性溶液中呈蓝色,微量滴定管：滴定管与贮液管，无气泡或气柱,2.6二氯酚靛酚法：测定还原性Vc,2023年4月2日星期日,185,测定蛋白质的方法,双缩脲法Folin-酚法紫外吸收法凯氏定氮法考马斯亮蓝法,蛋白质+考马斯亮蓝G-250蛋白色素复合物最大光吸收波长：595 nm,2023年4月2日星期日,186,紫外分光光度计,光源：氢、氘灯,可见光分光光度计,光源：钨灯,玻璃比色杯,石英比色杯,摩尔消光系数：A=L CL=1cm，C=1mol/L，在一定波长下的吸光度（光吸收值）,共轭双键,离心机：配平,