第八版生物化学与分子生物学 DNA的生物合成课件.ppt

1,生物化学与分子生物学,2,第十四章,DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication),3,复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。,4,本章主要内容：,DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程真核生物DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式,DNA复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,6,半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,7,一、DNA以半保留方式进行复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,8,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,10,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,11,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,12,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),14,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,16,三、DNA复制反应呈半不连续特征,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),17,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(lagging strand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,18,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,19,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,20,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,21,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需RNA引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,22,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：,1.53 的聚合活性2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,24,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,25,原核生物的DNA聚合酶,26,个核心酶1个-复合物（、6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括：,27,亚基（130 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用,28,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用,-复合物由6种亚基组成：、,29,功能：,DNA-pol（109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,30,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,31,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,32,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,33,真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较,34,真核生物的DNA聚合酶,35,二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,36,遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,37,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。,38,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,39,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,40,三、复制中的解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,41,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,42,E.Coli 基因图,43,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,44,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态,复制过程正超螺旋的形成：,45,解链过程中正超螺旋的形成,46,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,47,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,48,拓扑酶的作用方式：,49,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,51,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,52,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,53,原核生物DNA复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,54,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、复制的起始,55,E.coli复制起始点 oriC,（一）DNA的解链,56,原核生物的复制起始部位及解链,57,58,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（二）引物合成和引发体形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,59,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,60,引发体和复制叉的生成,61,62,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,64,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,后随链的合成,66,在复制叉同时合成前导链和后随链,复制过程简图,68,69,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,70,子链中的RNA引物被取代,71,72,73,真核生物DNA生物合成过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,74,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,75,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,76,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,一、真核生物复制的起始与原核基本相似,77,酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：,酵母染色体含有多个复制起点。,元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)。3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。,酵母复制起始点,78,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,79,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,80,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继续合成DNA子链。,二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,81,前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力。DNA聚合酶/转换的关键蛋白是RFC。,DNA聚合酶/转换,82,真核DNA聚合酶转换和后随链合成,83,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,84,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,85,切除引物的两种机制,86,前导链产生完整的子染色单体。后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,88,端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3。这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。,89,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成：,90,端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成。端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链。,91,端粒酶催化作用的爬行模型,92,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,93,前复制复合物在G1期形成而在S期被激活,真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活。,复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。,94,复制基因的选择出现于G1期，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。复制起点的激活出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。,在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。,95,ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1。,复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。,三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7。,前复制复合物（pre-RC）的形成,96,pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子并起始复制，复制因子包括3种DNA聚合酶。DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和Pol 结合，然后是Pol/引发酶。,在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，从而被激活。,97,pre-RC的激活和组装真核DNA复制叉,98,（1）激活pre-RC，以起始DNA复制；（2）抑制形成新的pre-RC。,CDK控制pre-RC的形成和激活,真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活。,Cdk功能：,99,在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的pre-RC并迅速结合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其它组分结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。,100,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第五节,101,双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。,102,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制,RNA,DNA,103,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,104,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。,105,逆转录酶催化的cDNA合成,106,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,107,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,108,三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制,109,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制,110,D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。,