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    第10章DNA的生物合成(11采用)课件.ppt

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    第10章DNA的生物合成(11采用)课件.ppt

    第10章,DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication),复制(replication)是指遗传物质的传代,以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,DNA的生物合成有三种方式:复制逆转录损伤DNA的修复合成,本章主要内容:,复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤(突变)与修复,复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,DNA生物合成时,母链DNA解开为两股单链,各自作为模板(template)按碱基配对规律,合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA,一股单链从亲代完整地接受过来,另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留,半保留,混合式,亲代DNA,子代DNA,(四)半保留复制的证明实验,细菌可以利用NH4Cl作氮源合成DNA,轻链14N-DNA,重链15N-DNA,轻、重链DNA混合,半保留复制第一代DNA,半保留复制第二代DNA,半保留复制第三代DNA,细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养后提取DNA,把细菌放在含15NH4Cl 的培养液中培养若干代后提取含15N的“重”DNA,把含15N-DNA的细菌放回含NH4Cl 的普通培养液中培养20分钟后提取子一代DNA,把含15N-DNA的细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养40分钟后提取子二代DNA,将轻链DNA和重链DNA混合,把含15N-DNA的细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养60分钟后提取子三代DNA,普通培养液培养细菌的轻链DNA在密度梯度离心时区带在离心管上方,子二代DNA密度梯度离心分析时有介于重带与轻带之间的中间带轻带两种,将轻链和重链DNA混合后密度梯度离心时在离心管中有与轻、重链对应的两条区带,子三代DNA密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种,以后各代DNA分子密度梯度离心结果相同,但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。,含15NH4Cl培养液培养的重链DNA在密度梯度离心时区带在离心管下方,子一代DNA密度梯度离心分析时致密带介于重带与轻带之间,没有单独的重带和轻带,实验结果说明,子一代DNA双链中一股是15N单链,从亲代接受和保留下来的;另一股是14N单链,完全是新合成的。Messelson和Stahl的实验支持半保留复制。,半保留复制的意义按半保留复制方式,子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致,即子代保留了亲代的全部遗传信息,体现了遗传的保守性。,遗传的保守性是物种稳定性的分子基础,但不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性。,原核生物复制时,DNA从起始点(origin)向两个方向解链,形成两个延伸方向相反的复制叉,称为双向复制。,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,复制中的放射自显影图像(眼睛状图形)(大肠杆菌DNA经放射性标记后电镜下观察结果),复制叉指的是DNA双链分成两股各自作为模板,子链沿模板延长形成的Y字形结构,复制叉指的是DNA双链分成两股各自作为模板,子链沿模板延长形成的Y字形结构,真核生物每个染色体有多个起始点,是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,复制起始点、复制子与复制叉(动画演示),5,3,解链方向,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),领头链连续复制,随从链不连续复制,这就是复制的半不连续性,DNA的两股单链走向相反,一股为5至3,另一股(互补链)为3至5。复制叉上两股母链也是走向相反。子链沿母链模板复制,只能从5向3延伸。同一个复制叉上只能有一个解链方向。,顺着解链方向生成的子链,复制是连续进行的,这股链称为领头链。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反,不能顺着解链方向连续延长,这股不连续复制的链称为随从链。,冈崎片段,复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,顺着解链方向生成的子链,复制是连续进行的,这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反,不能顺着解链方向连续延长,这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制,就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP;聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶,简写为 DNA-pol;模板(template):解开成单链的DNA母链;引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合;其他的酶和蛋白质因子。,DNA复制是模板依赖性的,必须要以亲代DNA链作为模板。DNA分子的碱基埋在双螺旋内部,只有把DNA解成单链,它才能起模板作用。亲代DNA的两股链解开后,可分别作为模板进行复制。,(一)模板,一、模板、底物、引物,以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物,即dATP,dGTP,dCTP,dTTP。,(二)底物(原料),核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需引物和模板;新链的延长只可沿5 3方向进行。,引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP),该酶以DNA为模板,聚合一段RNA短链引物(primer),以提供自由的3-OH,使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,(三)RNA引物,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,全称:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称:DNA-pol活性(作用)有两方面:53 的聚合活性,延53方向延长脱氧核苷酸链。核酸外切酶活性(两种情况)3 5外切酶活性,能辨认错配的碱基对,并将其水解。5 3外切酶活性,能切除突变的 DNA片段。,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,核酸外切酶活性,3 5外切酶活性能辨认错配的碱基对,并将其水解。,5 3 外切酶活性能切除突变的 DNA片段。,合成中的DNA分子,(一)原核生物的DNA聚合酶分为三型,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物的DNA聚合酶,三种酶共同点:5 3 聚合酶活性 3 5外切酶活性,功能:,DNA-pol(109kD),对复制中的错误进行校读,对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA,进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol(120kD),DNA-pol II基因发生突变,细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高,即使在已发生损伤的DNA模板上,它也能催化核苷酸聚合。因此认为,它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能:,DNA-pol(250kD),是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。(Pol 活性高于Pol:每分钟达105次聚合反应。),10个亚基组成的不对称二聚体,滑动夹子(两个亚基)(2围绕双螺旋形成一个 环,模板链从该环通过)稳夹模板并沿模板滑动 复合物 夹子装载,核心酶(、亚基)亚基有5 3方向聚合作用(105/分)。亚基具有35核酸外切酶 活性,起校读作用,(二)常见的真核细胞DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发,有引物酶活性。,延长子链的主要酶,有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,注:五种酶共同点 5 3 外切酶活性,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行,是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,(一)核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶,外切酶是有方向性的。,A:DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基;并用其聚合活性掺入正确配对的底物(错配修复、即时校读)。B:碱基配对正确,DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,(二)复制的保真性依赖DNA聚合酶正确的碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价(磷酸二酯键)键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型,与相应的嘧啶形成氢键配对,嘌呤应处于反式构型。,遵守严格的碱基配对规律;聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能;复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:,四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部,只有把DNA解成单链,它才能起模板作用。,(一)多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E.Coli 基因图,解螺旋酶(helicase),又称解链酶或rep蛋白(dnaA、B、C),是用于解开DNA双链的酶蛋白。每解开一对碱基,需消耗2分子ATP。,1、解螺旋酶,单链DNA结合蛋白(single strand binding protein,SSB),是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,2、单链DNA结合蛋白,SSB的生理作用:,使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在,即稳定单链DNA,便于其作为模板复制子代DNA;保护单链DNA,避免核酸酶的降解。,引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP),由dnaG基因编码,该酶以DNA为模板,聚合一段RNA短链引物(primer),以提供自由的3-OH,使子代DNA链能够开始聚合。(注:DNA聚合酶没有催化游离dNTP之间相互聚合的能力)引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,3.引物酶,复制过程正超螺旋的形成:,(二)DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,复制速度快,旋转达100次/秒,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶(原:-蛋白 真:转轴酶、解缠酶、切口-封闭酶、松弛酶)拓扑异构酶(原:旋转酶 真:几种亚型),拓扑异构酶分类:,拓扑异构酶作用特点:,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链,使DNA解链旋转不致打结;适当时候封闭切口,DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链,断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能,连接断端,DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制:,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式:,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用:,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能:,DNA生物合成过程The Process of DNA Replication,第 三 节,(一)复制起始:DNA解链形成引发体,需要解决两个问题:,1.DNA解开成单链,提供模板。,2.形成引发体,合成引物,提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1.DNA解链,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,(二)复制的延长过程:领头链连续复制,随从链不连续复制,复制的延长指在DNA-pol催化下,dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上,其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成:,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,随从链的合成,同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长,DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA,双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,(三)复制的终止过程:切除引物、填补空缺、连接切口,随从链上不连续性片段的连接:,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂,决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节,与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点,是多复制子复制。复制有时序性,即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制起始点比大肠杆菌起始点OriC短(11bp)复制的起始需要DNA-pol(引物酶活性)和pol(解螺旋酶活性)参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,(一)真核生物复制的起始与原核基本相似,增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体,具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象,即形成闭合环形的可滑动DNA夹子,在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链;并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后,DNA-pol 通过PCNA的协同作用,逐步取代pol,在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同,pol 置换pol,继续合成DNA子链。,(二)真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长:,真核生物的DNA复制与核小体装配同步进行,染色体DNA呈线状,复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接,复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物,去除后留下空隙。,(三)端粒酶参与解决染色体末端复制问题,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能:,维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点:,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成:,端粒DNA末端,1、端粒酶靠hTR(AnCn)x与母链DNA端粒结合,内在模板RNA,2、以端粒酶RNA为模版,逆转录,延长DNA母链,3、端粒酶移位、空出RNA模板,再次延长母链,同时DNA母链反摺利于下游复制延伸。,4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链,代之以DNA-Pol。此时母链3-OH反折,同时作为引物和模板,完成末端双链复制。,DNA-Pol,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第四节,双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体,它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒,真核生物的线粒体DNA,都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组,采用特殊的方式进行复制。,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组是RNA,其复制方式是逆转录,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息,并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下,前病毒基因组通过基因重组(recombination),参加到细胞基因组内,并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合,都可成为致病的原因。,逆转录病毒的生活周期,RNA病毒粒子,病毒RNA,RNA DNA 逆转录酶,DNA(前病毒),和宿主细胞DNA整合,c-src,整合后的DNA进行复制,v-src,静止或激活而表达,宿主细胞DNA,分子生物学研究可应用逆转录酶,作为获取基因工程目的基因的重要方法之一,此法称为cDNA法。,以mRNA为模板,经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象,是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明:至少在某些生物,RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究,拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,DNA损伤(突变)与修复DNA Damage(Mutation)&Repair,第五节,DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化,也称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看,突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变在生物界普遍存在,(一)突变是进化、分化的分子基础,从长远的生物史看,进化过程是突变的不断发生所造成的。大量的突变都是属于这种类型,只是目前还未能认识其发生的真正原因,因而名为自发突变或自然突变(spontaneous mutation)。,(二)只有基因型改变的突变形成DNA的多态性,这种突变没有可察觉的表型改变,例如在简并密码子上第三位碱基的改变,蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。,(三)致死性的突变可导致个体、细胞的死亡(四)突变是某些疾病的发病基础,二、多种化学或物理因素可诱发突变,大量的突变属于自发突变,发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大,细胞繁殖速度快,因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变,也是生活环境中导致突变的因素,主要有物理和化学因素。,物理因素:紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,化学因素:,三、引起突变的分子改变类型有多种,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区,可导致氨基酸改变。,(一)错配可导致编码氨基酸的改变,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,镰形红细胞贫血病人,图10-29膀胱癌细胞c-ras H基因点突变,基因表达产物仅12号氨基酸的变异,(二)缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变,缺失:一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入:原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失引起框移突变:,(三)重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病,DNA分子内较大片段的交换,称为重组或重排。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置(倒位),也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型:,DNA损伤(突变)可能造成两种结果:其一是导致复制或转录障碍(如胸腺嘧啶二聚体,DNA骨架中产生切口或断裂);其二是导致复制后基因突变(如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶),使DNA 序列发生永久性改变。所以,必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制,以识别和修复这些损伤,否则细胞无法维持正常代谢。,四、DNA损伤的修复有多种类型,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施,使其回复为原有的天然状态。,错配修复(mismatch repair)直接修复(direct repair)光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型:,(一)直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光修复酶(photolyase),UV,(二)核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形,这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的DNA,填补空隙和连接。主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤,而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶,即参与转录偶联修复(transcription-coupled repair)。转录偶联修复的意义在于,将修复酶集中于正在转录的DNA,使该区域的损伤尽快得以修复。,(三)重组修复,(四)SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时,由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli,各种与修复有关的基因,组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低,对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复,复制如能继续,细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多,导致较广泛、长期的突变。,

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