生物化学第8章 核酸代谢课件.ppt
第十一章 核酸的代谢,第一节 核酸的消化吸收,核酸的降解过程,核酸酶：作用于核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶,按其作用位置分为:一.核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3端或5端），逐个水解下核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶：只作用于DNA 核糖核酸外切酶:只作用于RNA二.核酸内切酶:从核酸分子内部切断3，5-磷酸二酯键。,限制性内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，可用于特异切割DNA,常作为工具酶。,某些核酸外切酶对RNA、DNA均有作用：,牛脾磷酸二酯酶3-核苷酸,蛇毒磷酸二酯酶5-核苷酸,第二节 核苷酸的分解代谢一、核酸的分解 核苷酸+H2O 核苷+Pi 核苷+H2O 嘌呤（或嘧啶）+戊糖（核苷水解酶主要存在于植物和微生物体内，并且只能对核糖核苷起作用，对脱氧核糖核苷不起作用。）核苷+H3PO4 嘌呤（或嘧啶）+1-磷酸戊糖（核苷磷酸化酶存在广泛）,核苷酸酶,核苷水解酶,核苷磷酸化酶,二、嘌呤的降解：这是一个氧化降解过程，不同生物降解的产物不同。,腺嘌呤 鸟嘌呤 H2O H2O NH3 NH3 次黄嘌呤 黄嘌呤 H2O+O2 H2O2 H2O+O2 H2O2 尿囊素 尿酸 H2O CO2+H2O2 2H2O+O2 尿囊酸 尿素+乙醛酸 H2O 2H2O 4NH3+2CO2,（人类和灵长类动物、爬虫、鸟类）,（灵长类以外的哺乳动物）,（植物）,（鱼类、两栖类）,（海洋无脊椎动物）,腺嘌呤脱氨酶,鸟嘌呤脱氨酶,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤氧化酶,尿酸氧化酶,尿囊素酶,尿囊酸酶,脲酶,三、嘧啶的降解：这是一个还原降解过程。胞嘧啶 尿嘧啶 二氢尿嘧啶 H2O NH3 NAD(P)H+H+NAD(P)+H2O-丙氨酸-脲基丙酸 H2O 胸腺嘧啶 二氢胸腺嘧啶 NAD(P)H+H+NAD(P)+H2O-氨基异丁酸-脲基异丁酸 H2O,胞嘧啶脱氨酶,二氢尿嘧啶脱氢酶,二氢嘧啶酶,脲基丙酸酶,二氢尿嘧啶脱氢酶,二氢嘧啶酶,脲基丙酸酶,NH3+CO2+,NH3+CO2+,第三节 核苷酸的合成,一、嘌呤核苷酸的生物合成1N:来源于天冬氨酸 2、8C:来源于甲酸 3、9N:来源于谷氨酰胺4、5C和7N:来自甘氨酸 6C:来自CO2,PRPP,IMP,FH4,IMP+Asp,延胡索酸+AMP,GTP GDP+Pi,腺苷酸的合成,腺苷酸琥珀酸合成酶腺苷酸琥珀酸裂解酶,羽田杀菌素（Asp的类似物）,鸟苷酸的形成,谷氨酰胺,谷氨酸,IMP,XMP,GMP,ATP AMP+PPi,H2O,NAD+NADH+H+,脱氢酶,合成酶,嘌呤核苷酸的生物合成（从头合成）：,嘌呤核苷酸的合成结果直接形成IMPIMP合成从5-P-核糖开始的，在ATP参与下先形成PRPP嘌呤的各个原子是在PRPP的C1上逐渐加上去的。由Asp、Gln、Gly、甲酸、CO2 提供N和C四氢叶酸（FH4）是一碳单位的载体,嘧啶核苷酸的嘧啶环是由氨甲酰磷酸 和天冬氨酸合成的。,二、嘧啶核苷酸的生物合成,氨甲酰磷酸,天冬氨酸,尿苷酸的生物合成,其合成与嘌呤核苷酸的合成不同，先利用小分子化合物形成嘧啶环，再与核糖磷酸（PRPP）结合形成UMP，其关键的中产物是乳清酸。其他嘧啶核苷酸由尿苷酸转变而来,胞苷酸的生物合成 UMP UDP UTP ATP ADP ATP ADP UTP+NH3+ATP CTP+ADP+Pi(细菌体内)在动物体内,由谷氨酰胺代替氨参加反应提供氨基 UTP+谷氨酰胺+ATP+H2O CTP+谷氨酸+ADP+Pi,尿嘧啶核苷酸激酶,核苷二磷酸激酶,CTP合成酶,三、脱氧核糖核苷酸的生物合成（大肠杆菌、动物、植物）NMP+ATP NDP+ADP NDP 核糖核苷二磷酸还原酶 dNDP SH S 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白 SH S(FAD)硫氧还蛋 白还原酶 NADP+NADPH+H+,（dADP、dGDP、dCDP、dUDP),激酶,B1 B2,dATP dGTPdCTP dUTP,激酶,其它原核细胞中：,NTP dNTP到目前为止，脱氧核糖核苷酸的生物合成机制仍然不太清楚,VB12、二氢硫辛酸还原剂,胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP）的合成 dUDP+H2O dUMP+Pi dCMP+H2O dUMP+Pi 胸腺嘧啶核苷酸合酶 dUMP dTMP N5,10亚甲基四氢叶酸 二氢叶酸,酯酶,脱氨酶,甲基化,辅酶核苷酸的生物合成,DNA的生物合成,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,中 心 法 则,1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒,1958年，遗传信息的单向,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,一、DNA的复制方式半保留复制定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。,二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌 中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物。,催化因子1.引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。2.DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶，其催化反应的特点（1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；（2）反应需要有模板的指导；（3）反应需要有3-OH存在；（4）DNA链的合成方向为5 3,生物大分子合成：底物、酶、能量、模板,（5）DNA聚合酶的反应可以利用DNA双链作为模板和引物，亦可以单链DNA作为模板和引物,（6）DNA的体外聚合必须加入少量的DNA才能进行。DNA在提取过程中易形成切口（nick）或缺口（gap）.则加入的DNA一条链作为模板而另一条链可作为引物。,原核生物中的DNA聚合酶,在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶（用突变株研究其功能）：DNA聚合酶:单体酶,它具有5 3 聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；3 5外切酶活性（对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）及5 3外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）；在DNA链的3 形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。DNA聚合酶：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3 5外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,DNA聚合酶：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、形成全酶的核心酶。具有53DNA聚合酶活性（亚基，速率高）；具有3 5外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有5 3外切酶活性（单链有效，其意义未知）。（4）DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。,DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目 1（单体酶）1（多亚基酶）1（多亚基酶）5 3聚合活性+中+很低+很高3 5外切活性+（保护DNA复制的忠实性fidelity）5 3外切活性+-,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要聚合酶，还具有3-5 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,在真核细胞内有五种DNA聚合酶（与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核3-5外切-+酶活性功能,引物 合成,修复作用,线粒体DNA的复制,核DNA的复制,修复作用,3.DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。二者共同控制DNA的拓扑结构。5、解螺旋酶（解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,4.拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶,6.其它蛋白因子：,三、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段,1、双链的解开,一些概念：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状，只有一个复制原点，而真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。,复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome）,DNA的双向复制,（2）RNA引物的合成,引发体在复制叉上移动，沿模板链5 3的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点，DnaB蛋白活化引物合成酶。引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3 5),按5 3的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸，在引物的5端含3个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3端为游离的羟基。,（3）DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷5-三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。,领头链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。随从链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。半不连续复制在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。,冈崎片段 在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。,（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）,当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有一个终止区）。这时会发生一系列变化：在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基；以修复方式填补终止区50-100bp的空缺。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。,四、真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,五、逆转录,病毒RNA的逆转录过程（以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化）单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒）,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。,六、DNA的损伤修复DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式：一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失 DNA的损伤修复 四种修复途径:光复活、切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。,光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT（CC CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,DNA的合成方式：,DNA的复制：以DNA为模板 合成DNA。逆转录：以RNA为模板合成DNA。修复合成（DNA聚合酶I、连接酶等）,RNA的生物合成,一、概念转录：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。以四种核糖核苷三磷酸酸（NTP）为底物，形成3、5-磷酸二酯键相连接。转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链（编码链，正链）在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。,二、RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基2 组成，因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2分离，没有、亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：亚基：与启动子结合功能。亚基：含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二酯键。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。亚基：与DNA模板结合功能。亚基：识别起始位点。,真核细胞的RNA聚合酶,酶类,分布,产物,-鹅膏蕈碱对酶的作用,分子量,反应条件,I,核仁,核质,核质,rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA,mRNA,tRNA 5SrRNA,不抑制,低浓度抑制,高浓度抑制,500 000700 000,700 000,_,低离子强度,要求Mg2+或Mn2+,高离子强度,高Mn2+浓度,RNA聚合酶的特点：,1、反应底物：NTP，DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。RNA聚合酶不需要引物，合成方向53。2、真核生物与原核生物的RNA聚合酶结构不同（具体 说明）。3、利福平抑制原核生物RNA聚合酶活性；-鹅膏蕈碱 抑制真核生物RNA聚合酶活性。,三、RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例）起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止,（1）起始位点的识别,RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会选择正确的起点。亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列P459）的作用。启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。,（2）转录起始,RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，亚基就会被释放脱离核心酶。,因子仅与起始有关，RNA的合成一旦开始，便被释放,（3）RNA链的延伸,DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 3,（4）转录终止,在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。,需要因子（终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号）帮助，因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。,不依赖于因子。强终止子序列有两个明显的特征：（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。,四、RNA的转录后加工 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。,1、mRNA前体的加工：原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括：（1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。（2）3端添加polyA“尾巴”；（3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,2、tRNA前体的加工：原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括：（1）由核酸内切酶切除前体上3和5端上多余的核苷酸；（2）由核酸外切酶逐个在3切去附加序列，进行修剪。（3）3端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。（接受活化AA）（4）核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。,原核与真核生物的rRNA转录后也都需要进行加工。原核：刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化（核糖2-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。真核：45S（哺乳动物）、38S（果蝇）、37S（酵母）,P16,P23,P5,16S,23S,5S（一般不含甲基化）,28S,18S,5.8S,3、rRNA前体的加工：,45S或38S,37S,26S17S5.8S,真核rRNA的甲基化程度比原核高（核糖2-羟基）,rRNA原初转录物,研究四膜虫rRNA前体的拼接时发现ribozyme,
