核酸代谢 ppt课件.ppt

,食品生物化学,第十三章 核酸代谢,嘌呤核苷酸的合成嘧啶核苷酸的合成脱氧核糖核苷酸的生成核酸的分解代谢DNA的复制,作为核酸合成的原料，是核酸的基本组成单位；体内能量的利用形式，ATP是重要能量货币；参与代谢和生理调节，cAMP是第二信使；组成辅酶，如NAD、FAD、CoA等；活化中间代谢物，其衍生物是许多生化反应的中间供体，如UDPG、SAM等。,核苷酸的生物功能,第一节 核酸的生物合成,核苷酸生物合成的基本途径,从头合成途径：肝 主要途径(de novo synthesis pathway)补救合成途径：脑、骨髓等，也很重要。(salvage synthesis pathway),核苷酸合成的两条途径,核糖、氨基酸、CO2、一碳单位,核糖核苷酸,脱氧核苷酸,辅酶,RNA,核苷,碱基,脱氧核苷,DNA,补救途径 从头合成,嘌呤核苷酸的合成,指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及二氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反应，合成嘌呤核苷酸的途径，不经过碱基和核苷的阶段。,主要器官是肝，其次是小肠和胸腺，而脑、骨髓则无法进行此途径。,一、嘌呤核苷酸的从头合成,1.定义,2.合成部位,从头合成途径的全过程,IMP的合成,AMP和GMP的生成,ATP和GTP的生成,嘌呤环上各原子的来源,CO2,天冬氨酸,甲酰基（一碳单位）,甘氨酸,甲酰基（一碳单位）,谷氨酰胺（酰胺基）,合成途径：两个阶段5-磷酸核糖 次黄嘌呤核苷酸（IMP）IMP AMPGMP,R-5-P（5-磷酸核糖）,PP-1-R-5-P（磷酸核糖焦磷酸）,在谷氨酰胺、甘氨酸、一碳单位、二氧化碳及天冬氨酸的逐步参与下,IMP,H2N-1-R-5-P（5-磷酸核糖胺）,5-磷酸核糖 次黄嘌呤核苷酸（IMP）,PRPP核苷酸核糖磷酸部分的供体,磷酸核糖焦磷酸激酶,5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）,5-磷酸核糖焦磷酸,转酰氨酶,5-磷酸核糖胺,合成酶,甘氨酰胺核苷酸,甘氨酰胺核苷酸,转甲酰基酶,甲酰甘氨酰胺核苷酸,合成酶,甲酰甘氨咪核苷酸,5-氨基咪唑核苷酸,合成酶,甲酰甘氨咪核苷酸,羧化酶,5-氨基咪唑-4-羧酸核苷酸,合成酶,5-氨基咪唑-4-(N-琥珀基)氨甲酰核苷酸,裂解酶,5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,转甲酰基酶,5-甲酰胺基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,水解酶,次黄嘌呤核苷酸,5-磷酸核糖焦磷酸,磷酸核糖焦磷酸转酰氨酶,5-磷酸核糖胺,甘氨酰胺核苷酸,甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶,甲酰甘氨酰胺核苷酸,甲酰甘氨酰胺核苷酸,甲酰甘氨咪核苷酸,甲酰甘氨咪核苷酸,5-氨基咪唑核苷酸,氨基咪唑核苷酸合成酶,N5-羧基氨基咪唑核苷酸,氨基咪唑羧化酶,5-氨基咪唑核苷酸,5-氨基咪唑-4-羧酸核苷酸,N5-羧基氨基咪唑核苷酸,5-氨基咪唑-4-羧酸核苷酸,合成酶,5-氨基咪唑-4-(N-琥珀基)氨甲酰核苷酸,5-氨基咪唑-4-(N-琥珀基)氨甲酰核苷酸,裂解酶,5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,转甲酰基酶,5-甲酰胺基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,5-甲酰胺基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,水解酶,次黄嘌呤核苷酸（IMP）,腺苷酸代琥珀酸合成酶 IMP脱氢酶腺苷酸代琥珀酸裂解酶 GMP合成酶,AMP和GMP的生成,ATP和GTP的生成,嘌呤核苷酸是在磷酸核糖分子上逐步合成的；形成的第一个核苷酸是次黄嘌呤核苷酸(IMP)；IMP的合成需5个高能磷酸键；AMP或GMP的合成又各需1个ATP。,嘌呤核苷酸从头合成特点,利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单的反应，利用腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，合成嘌呤核苷酸的过程，称为补救合成（或重新利用）途径。,二、嘌呤核苷酸的补救合成途径,1.定义,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyl transferase,APRT)次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT),2.参与补救合成途径的酶,3.合成过程,4.补救合成的生理意义,补救合成途径可以节省从头合成途径时所需的能量和一些氨基酸的消耗。体内某些组织器官，如脑、骨髓等只能进行补救合成。,嘧啶核苷酸的合成,一、嘧啶核苷酸的补救合成途径,嘧啶核苷酸的结构,二、嘧啶核苷酸的从头合成途径,主要是肝细胞胞液,指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及二氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反应，不经过碱基和核苷的阶段，直接合成嘧啶核苷酸的途径。,1.定义,2.合成部位,3.嘧啶环上各原子的来源,4.合成过程,合成原料：谷氨酰胺、天冬氨酸、CO2、磷酸核糖。合成特点：（1）用原料先合成嘧啶环；（2）再与磷酸核糖连接生成嘧啶核苷酸；（3）合成的第一个核苷酸是乳清酸核苷酸；（4）乳清酸核苷酸再转变为UMP。,5.尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的合成,UDP,UTP,脱氧核苷酸的生成,脱氧核苷酸的生成,在核苷二磷酸水平上生成,dUMP,dTMP,dTMP的生成,核苷酸的抗代谢物,嘌呤核苷酸的抗代谢物,嘌呤核苷酸的抗代谢物是一些嘌呤、氨基酸或叶酸等的类似物。,次黄嘌呤(H),6-巯基嘌呤(6-MP),6-巯基嘌呤的结构,氨基蝶呤和氨甲蝶呤（叶酸拮抗物）在癌症治 疗中的应用原理（如何影响核酸合成）？,二者都是叶酸的类似物，竞争性地抑制由叶酸转化为二氢叶酸和四氢叶酸时的二氢叶酸还原酶的活性，使叶酸无法有效地转变为二氢叶酸和四氢叶酸；影响嘌呤和嘧啶核苷酸合成中一碳单位的转移，减少脱氧胸苷酸的合成，使快速分化的癌细胞由于缺乏dTMP而不能合成DNA，达到使细胞死亡的目的。,嘧啶核苷酸的抗代谢物,嘧啶类似物,胸腺嘧啶(T),5-氟尿嘧啶(5-FU),5-F-尿嘧啶的抗癌原理,5-F-尿嘧啶是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制剂；在体内转化为相应的核苷一磷酸和核苷三磷酸后，它可以与酶上的SH基结合，再与四氢叶酸形成三元复合物；酶不能去除F，而干扰了脱氧尿嘧啶的甲基化，进而不能合成dTMP，也就使快速分化的癌细胞由于缺乏dTMP而不能合成DNA，达到使癌细胞死亡的目的。,第二节 核酸的代谢,核酸和核苷酸的降解,定义：指所有可以水解核酸的酶。依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA的酶。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA的酶。依据切割部位不同核酸内切酶：限制性核酸内切酶 非限制性核酸内切酶核酸外切酶：53或35核酸外切酶,核酸酶（Nuclease）,外切核酸酶对核酸的水解位点,5,OH,B,3,B,B,B,B,B,B,B,牛脾磷酸二酯酶（5端外切5得3）,蛇毒磷酸二酯酶（3端外切3得5）,内切核酸酶对RNA的水解位点,RNAase I,RNAase I,RNAase T1,RNAase T1,Pu：嘌呤 Py：嘧啶,实际上就是碱基的分解代谢,核苷酸的分解代谢,人类嘌呤碱的最终代谢产物,AMP,GMP,H（次黄嘌呤）,G,X（黄嘌呤）,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤氧化酶,一、嘌呤核苷酸的分解,嘌呤碱的分解代谢,不同生物体内存在的酶不同，使得嘌呤碱分解的终产物不同,人类和排尿酸动物尿酸为终产物其它哺乳动物尿囊素鱼类、两栖类尿囊酸无脊椎动物、甲壳类NH3+CO2,痛风症,痛风与嘌呤代谢平衡发生障碍有关，其基本生化特征是高尿酸血症，由于尿酸的溶解度很低，尿酸以钠盐或钾盐的形式沉积于软组织及关节等处，形成尿酸结石或关节炎。,二、嘧啶核苷酸的分解,胞嘧啶,NH3,尿嘧啶,二氢尿嘧啶,H2O,CO2+NH3,-丙氨酸,胸腺嘧啶,-脲基异丁酸,-氨基异丁酸,H2O,丙二酸单酰CoA,乙酰CoA,TCA,肝,尿素,甲基丙二酸单酰CoA,琥珀酰CoA,TCA,糖异生,嘧啶碱的分解代谢,DNA的复制,DNA复制的发现：,Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构之后，又提出了DNA复制的假说：DNA半保留复制模型；1958年，Meselson米西尔森和Stanl斯坦尔采用含15N重同位素的NH4Cl培养大肠杆菌，放在正常的培养液里繁殖，然后用梯度离心技术测定分裂时DNA复制时的密度变化，证实了DNA的半保留复制。,实验结论：DNA的复制是以半保留的方式进行,DNA的半保留复制 指在DNA聚合酶的作用下，以一个亲代DNA分子的两条链为模板，合成两个结构上完全相同的子代DNA分子的过程。,复制时间,体细胞有丝分裂的间期、有性生殖细胞减数分裂第一次分裂的间期。,1.破坏氢键，打开DNA双链2.游离核苷酸与母链碱基互补配对3.配对的游离核苷酸联结为子链4.子链与模板母链盘绕成双螺旋结构,复制过程,1.解 旋 DNA分子利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，使得DNA双链的氢键断裂，这样使得螺旋结构的DNA双链解开。,2.复制 以解开的每段DNA链（母链）为模板，以周围环境中游离的脱氧核苷酸为原料，在相关酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链。,3.分配 复制出来的子代DNA分子，通过细胞的分裂，被分配到子代细胞中。,复制叉（Replication Fork）,DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,复制的条件：1.模板：解旋的DNA分子；原料：细胞中游离的脱氧核苷酸 能量：ATP 酶：解旋酶、聚合酶等可以进行人工模拟复制,复制的特点：1.DNA分子是边解旋边复制的；2.半保留复制；,需要引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。,半不连续复制（semidiscontinuous replication）,由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以35方向的母链作为模板指导新的链以5 3方向连续合成；另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为前导链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,前导链(leading strand)：在引物的3端按53方向连续不断地合成的DNA链。随从链(lagging strand)：在引物的3端按53方向不连续合成的DNA链。冈崎片段(Okazaki fragment)：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）,DNA复制的条件,底物：以四种脱氧核糖核酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。模板(template)：DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。引物酶(primase)、引发体(primosome)、引发前体和RNA引物DNA聚合酶（DDDP）,通过DNA分子的复制，把亲代的遗传信息传给子代，从而使得前后代保持了一定的连续性。,DNA复制的意义,1.DNA分子具有独特的双螺旋结构；2.连接两条链的碱基有互补配对能力。,DNA复制的分子基础,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。DNA的复制、转录和翻译过程构成了遗传学的中心法则。,小结：,常用分子生物学技术的原理及应用,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)：不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,分子杂交,探针：是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中存在的特定基因。,印迹技术（Blotting Technique）,将生物大分子物质，核酸或蛋白质进行凝胶电泳分离成若干条带后，转移（印迹）到固化介质（常用NC膜、尼龙膜）上，再与探针进行杂交的反应。,印迹技术的类别及应用,DNA印迹(Southern Blot)：用于基因组特异基因的定位及检测，重组质粒和噬菌体的分析。,RNA印迹(Northern Blot)：用于RNA的定性分析，比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况。,蛋白质的印迹(Western Blot)：用于蛋白质定性,半定量及蛋白质相互作用研究。,其他：斑点印迹(dot blotting)、原位杂交(in situ hybridization)、DNA芯片技术(DNA chip),DNA印迹(Southern Blot)1、概念：将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性探针的杂交检测被转移的DNA片段的一种方法。这是由 E.Southern于1975年首先设计应用的，因而以其姓氏命名。,2、基本过程：（1）酶切：用限制性内切酶消化DNA样品（2）电泳：通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段按小分离（3）变性：将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性（4）转移：使胶中的DNA分子转移到固相支持物（NC膜或尼龙膜）上（5）固定：在80真空条件下加热或在紫外交联仪内 处理使DNA固定于膜上（6）杂交,3、应用：用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,RNA印迹(Northern Blot)：,1、概念：利用与DNA印迹相类似的技术分析RNA就称为RNA blot。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern blot。,2、基本过程：,与Southern Blot相似，但有以下不同：RNA分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割变性RNA的转移效率比较高,3、应用：,（1）检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平（2）比较不同组织和细胞中的同一基因的 表达情况,蛋白质印迹(Western Blot),1、概念：蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于DNA的Southern Blot和RNA的Southern Blot，蛋白质印迹被称为Western Blot。,2、基本过程：,(1)电泳（Electrophoresis）：一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。,蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。,(2)转膜(Transfer)：,(3)封闭(Blocking)：,封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用Westem印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。,(4)一抗孵育(Primary antibody incubation)：,特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合.,(5)二抗孵育(Secondary antibody incubation)：,碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。二抗需根据一抗进行选择。,(6)显色：,用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度.,放射自显影照片,3、应用：,（1）检测样品中特异蛋白质的存在（2）细胞中特异蛋白质的半定量分析（3）蛋白质分子的相互作用研究,三种印迹技术的比较,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体外核酸扩增技术,能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。,PCR技术的创建,Kary B.Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，扩增DNA的设想。1983年，Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B.Mullis（1944）,http:/,“I do my best thinking while driving”,1993 Nobel prize,概念：,PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链反应:在体外对目的DNA进行大量扩增的技术，当目的DNA加热变性时，使其成为单链，与一对特异性引物在退火时进行杂交，在耐热的DNA聚合酶作用下进行反应，并循环进行几十次，使目的DNA得到大量的扩增。基本理论建立在DNA变性、复性及分子杂交的基础之上。,PCR技术的特点 1.高度的敏感性 单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在一百万倍以上，即可将极微量(pg级)DNA，扩增到紫外光下可见的水平(g级)。它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。,2.高度的特异性 PCR扩增的特异性依赖于两个引物设计的特异性，依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性也有影响.在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR 扩增的特异性是相当高的。,3.操作简便、快速 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。4.适用样品的广泛性 既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。,PCR的基本原理,1、PCR反应体系 模板DNA 特异引物 底物dNTP 耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）Mg2+缓冲液,three steps:,Denaturation(变性):9097,Annealing(退火):4555,Extension(延伸):around 72,PCR的基本步骤,变性（denature）：将反应体系加热至90-97，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。退火（annealing）：当温度突然降低至45-65,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。延伸(extension)：将温度升高至70-74下，在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。,以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530）次即可达到扩增DNA片段的目的。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,5 Essential Components of PCR Reaction,