第十五章DNA重组技术的基本原理课件.ppt
第十五章 DNA重组技术的基本原理,第一节 DNA重组的技术要件,DNA重组技术：基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因工程的关键技术是DNA重组，但二者并不等同。,DNA重组的 技术路线,1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定,一、重要的工具酶及其作用特点,一般把DNA 分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。（一）限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）：是一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中的特定核苷酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二酯键断开，产生-OH和5-P基团DNA片段的内脱氧核酸酶(endodeoxyribonuclease)。,（四）逆转录酶,（五）RNA聚合酶,二、目的基因的载体类型及其功能,载体（vector）:能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。基因克隆载体必备条件：（1）受体细胞本来就有的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使外源DNA片段插入的多克隆位点（MCS，multiple cloning site）；（3）能进行自我复制，具有复制原点（ORI，origin）；（4）具有选择标记，承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。,（一）质粒及其功能,（二）噬菌体及其功能,（三）考斯质粒,（四）动物病毒的载体作用,（五）植物寄生菌作为目的DNA的载体Ti质粒（Ti plasmid）：是一种细菌质粒，存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）（革兰氏阴菌）细胞中，可诱导植物产生瘤细胞(Tumor-inducing,Ti)，冠瘿瘤（grown galltumors)。,诱导植物产生瘤细胞,第二节 DNA重组的基本技术步骤,1、目的基因的制备2、目的基因与载体的重组3、重组 体导入宿主细胞进行扩增4、克隆基因的鉴定,一、目的基因的制备方法基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为目的基因。,（一）建立DNA文库,某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包含某生物基因组全部DNA片段受体菌群体（一套克隆）称为这种生物的基因组文库。,基因组文库建立顺序,基因文库和cDNA文库的建立,组织,可克隆之DNA,载体,DNA,cDNA,mRNA,部分或完全酶解DNA,DNA长度分级,甲基化，双链接头DNA,DNA与载体连接,引入大肠杆菌,鉴定文库的滴度和特性,扩增后供长期储存,筛选出所需要的克隆,（三）人工合成DNA片段,（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA,1 PCR的原理：1985年Mullis发明PCR（polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为:Y=(1+X)n 式中 y一产量;X-扩增效率;n一循环次数。,PCR技术原理示意图,二、目的DNA和载体的体外连接,目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段组入合适的克隆载体。,三、将重组的DNA复合物导入受体细胞,基因克隆的受体细胞：是能摄取外源DNA(基因)并使其稳定维持的细胞。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。感受态细胞:指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。,（一）重组DNA分子转化大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。转化（transformation）：携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。,转化,（二）噬菌体重组体的转染转染：通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。,四、重组克隆的筛选方法,（一）利用载体的特殊标记进行筛选,（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采用斑点杂交或DNA印迹(southern blotting)等方法进行鉴定。（1）斑点杂交法 提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在分子杂交的膜上，用含目的基因DNA片段的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子。,（2）southern杂交法 斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染色体基因组上还是其他基因组上。而southern杂交（DNA印迹）则可对它进行定位。,（三）免疫学方法鉴定克隆,蛋白质印迹（western blotting）法：提取克隆子总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性抗体结合，通过抗原抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目的基因表达产物。,第三节DNA重组技术的应用前景,基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素,二、植物基因工程转化基因植物是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化和基因枪转化。,抗虫稻,对照,对照,转基因抗棉铃虫品种,受精卵细胞注射,转基因牛：受精卵注射法,转移有人类生长激素转基因鼠,人类生长激素转基因猪,四、遗传疾病诊断与基因治疗利用基因诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从 DNA即基因水平进行诊断，准确度高，速度快。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。,特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中使疾病得到纠正或治愈，通常叫做基因治疗(gene therapy)。方法：减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA)构建重组DNA分子用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞 将正常基因整合到染色体上。,2000年法国Fischer用基因工程方法治愈患有SCID（严重联合免疫缺陷）遗传病的两个婴儿(8个月和11个月)。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。,
