现代色谱分析技术的应用及进展课件.ppt

现代色谱分析技术的应用与进展(一)Application and Progress of Advanced Chromatography Analysis江南大学分析测试中心 戴军 Tel:85919609,E-mail:(食品科学与技术国家重点实验室222,224,217室),本课程内容及时间安排,第一章 色谱分析概论（3学时）第二章 气相色谱及其应用（8学时）第三章 高效液相色谱及其应用（13学时）第四章 色谱技术新进展（6学时）色谱分析实验 12学时(GC4学时,HPLC8学时),考核方式：闭卷书面考试，100分钟；综述:色谱分析技术的应用及进展（结合自已论文研究方向），5000字以上。考核成绩权重：书面考试50%；综述50%。,主要参考书及期刊:,1.达世禄编著，色谱学导论，第二版，武汉大学出版社，1999.2.戴军主编，食品仪器分析技术，化学工业出版社，2006.8汪正范 等,色谱联用技术,化学工业出版社,2001,1.Birendra N.Pramanik 等主编,蒋宏健 俞克佳 译,电喷雾质谱应用技术,化学工业出版社,2005,6.陈义 编著,毛细管电泳技术及应用,化学工业出版社,2000,9.色谱,分析测试学报,分析化学,Journal of Chromatography,Chromatographia,Biomedical Chromatography等相关期刊 专业网站：中国色谱网 www.SeP 中国分析仪器网 www.54PC.com,第1章 色谱分析概论,1.1 色谱法的定义和历史1.2 色谱法的特点和应用范围1.3 色谱分离的基本过程及原理1.4 色谱法的分类1.5 色谱的有关术语和概念1.6 塔板理论1.7 速率理论1.8 分离度方程及分离条件的控制,1.1 色谱法的定义和历史,定义 色谱法是一种分离(分析)方法:它利用物质在两相中分配系数的微小差异,通过两相的相对移动,使被测物质在两相之间进行反复多次分配,从而使各组分得到分离,并应用物理或化学方法进行检测,应用信息技术进行信号采集和数据处理分析,以达到定量或定性或分离制备的目的.,色谱法的历史发展,色谱发明人,俄国科学家：M.S.Tswett正式命名“色谱”的文献:,1.2 色谱法的特点和应用范围,特点 1.从本质上看,最大特点在于能将一个复杂的混合物分离为一个个组分,然后逐个检测.2.从形式上看,色谱法共同的基本特点是具备两个相：相对不动的一相，称为固定相；另一个相对运动的相，称为流动相。3.色谱法的优点:分离效率高 多组分同时分析 样品用量少 选择性好 检测灵敏度高 易于自动化 4.色谱法的缺点:定性能力较差(定量的“巨人”,定性的“侏儒”)应用范围 已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。大多数气体、液体和固体样品(必须能气化或溶解)都能找到相应的色谱方法进行分离和分析。,色谱分析的应用,与我们有关的应用领域:,风味成份酚类物质(葡萄酒、啤酒、黄酒)单糖、低聚糖(葡萄酒、啤酒、黄酒)肽、氨基酸(葡萄酒、黄酒),酒分析:,生物制品,多糖、大豆肽、谷胱甘肽、有机酸、氨基酸、茶多酚、茶色素、黄酮、生物碱、维生素等发酵产品和天然产物的功能性成分,环境分析,微囊藻毒素、多环芳烃、二噁英、环境激素(双酚A邻苯二甲酸酯等)等,代谢组学研究,生物代谢产物及代谢途径分析疾病诊断检测,蛋白组学研究,药物靶点的发现和确认药物作用机制药物毒理学研究,药物分析,药品质量检验和监测药代动力学,1.3 色谱分离的基本过程及原理描述,C1,2,C1,C2,C1,C2,M,S,跑道现象（表面）,洗涤原理（内在）,1.3 色谱分离的基本过程及原理描述,1.3 色谱分离的基本过程及原理描述,总言之:色谱分离是基于被分离物质的物理性质或化学性质的差异,归因于:样品组分与两个相（流动相和固定相）之间的作用力大小有差异,具有不同的平衡分配系数,进而产生差速移行.,由于上述作用力机制、种类不同,平衡分配系数的类型不一样,因而构成了多种不同的分离模式：,吸附,配位交换,离子交换,体积排阻,分配,亲和,疏水作用,手性,1.4 色谱法的分类,按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GS C）和气液色谱（GLC）液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC,早期液相色谱的一种类型,现较少使用）。随着色谱技术的发展，通过化学反应将固定液物质键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱称化学键合相色谱（CBPC,已广泛取代LLC）。超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。,按分离机理分类,利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度(或分配系数)不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或体积排阻色谱法。利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离.,What is“GPC”?,GPC gel,Elution volume,Exclusion Limit,GPC analysis,按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。,综上所述，色谱法的分类可总结于下图所示:,色谱法的分类,另外:对于液相柱色谱,气相色谱仪(GC)流程示意图,GC样机,高效液相色谱仪(HPLC)流程示意图,Dionex HPLC样机,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,本实验室仪器Agilent1100HPLC,自动进样器,柱温箱,在线脱气机,四元泵,溶剂瓶,二极管阵列紫外检测器(DAD),荧光检测器(FD),蒸发光散射检测器(ELSD),1.5 色谱的有关术语和概念,(1)色谱流出曲线 即色谱图（chromatogram）指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。,色谱流出曲线,h,(时间),（2）基线在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的连续的响应信号，一般是一条直线。,（3）峰高 峰的顶点到基线的垂直距离,即上图中的h。,（5）峰宽峰底宽Wb 半峰宽W1/2标准偏差,（4）峰面积 色谱曲线与基线间所包围的面积，即上图中CAD所围成的面积。峰面积和峰高与相应组分的量成正比，故可作为定量的依据。,（6）保留值保留时间tR进样到出现色谱峰的时间 保留时间是峰定性的依据之一保留体积VR进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积死时间t0流动相流过色谱柱所需时间(不保留组分流过色谱柱所需时间)死体积V0色谱柱的空隙体积(死时间内消耗流动相的体积),F流动相流动线速度,（7）相对保留值(用或表示,也称分离因子),（8）分配系数和分配比（容量因子）,分配系数：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值,分配比（容量因子）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相中量的比值,固定相中的组分质量流动相中的组分质量,K与k的关系：,（9）容量因子k与保留值的关系,(V0/Vs=,称相比),保留方程式,该方程将保留值tR与分离柱的基本参数t0和k相关联.由t0和k可预测tR理论值.由死时间t0和保留时间tR可求出容量因子k.,(10)分离效能指标,i)选择性（相对保留值,也叫分离因子；或）,两相邻组分的相对保留值,常用作为色谱系统分离选择性指标。相对保留值由两组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关。对于给定的色谱体系,在一定温度下,两组分相对保留值是一常数。因此，试样中各组分与标准(参照)物质的相对保留值可作为定性依据。,)峰宽度,)分离度,分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：,R 1.0两峰明显重叠R=1.0两峰达97.7%分离R 1.5两峰完全分开,定义:,1.6 塔板理论,目的从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数(及理论塔板高度)作为衡量柱效率的指标。,基本假设:,（1）色谱柱由若干级塔板组成;（2）组分通过时在每级塔板两相间可瞬间达到平衡，且纵向分子扩散可忽略；(3)组分在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在每个塔板上的量无关；（4）流动相通过色谱柱不是连续的，而是脉冲式的间歇过程，每次进入（转移）流动相一个塔板体积。,（塔板号）,下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：(每一塔板段的上下两格分别代表流动相和固定相),流动相进柱05个塔板体积时A、B两组分在各塔板上的分布,当经过1次转移（N=1）以后：,第0级塔板：r=0,A组分的分量=,若总结规律(以A组分为例)：,经N次转移后，组分在各级塔板上的量符合下列二项式分布，即,当N=4时，组分分布在5级塔板上的量分别是下式右边的各项：,以A组分为例，5级塔板上的分量分别是下式右边的各项：,任一级塔板上的分量为 的展开式对应的一项，可用一个通式表示：,当求 最后一级塔板的组分的量时，r=n，以,作图，即得色谱流出曲线，因此上式(1)称为流出曲线方程。,(1),对于两个组分A和B，如果k不同，则流出曲线的形状不同：,由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式：,将此方程与标准正态分布曲线方程-,或：,n 称为色谱柱的理论塔板数；neff 称为有效理论塔板数。对于特定的tR(或tR)，色谱峰越窄，理论塔板数n越大(塔板高度H越小)。,neff 与 n 的关系：,1、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；,小结,2、由下式(通过以上方程推得)看出表征柱效率的因素是理论板数n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好:,问题,怎样提高色谱柱的理论塔板数n，从而提高色谱柱的效率？,1.7 速率理论,(1)塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。,(2)Van Deemter方程1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：,(用塔板高度表征峰展宽的程度),涡流扩散示意图,式中：r弯曲因子，填充柱 r 1 空心柱r=1 Dm组分在流动相中的扩散系数,纵向分子扩散显著存在于GC中.由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。,该扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如右图所示。随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。,q 和 为与两相的构型和性质有关的常数dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度,Ds和Dm分别为组分在固定相和流动相中的扩散系数,何为传质阻力?,在色谱分离过程中溶质分子在流过色谱柱时反复不断地由流动相进入固定相，同时又由固定相进入流动相，这种溶质在两相间来回扩散的过程称为质量传递或传质。由于溶质分子与固定相、流动相分子间相互作用，阻碍溶质分子快速传递实现分布平衡，导致有限传质速率的分子间作用力称为传质阻力。因传质阻力的作用，加之流动相具有较高的流速，使得有些溶质分子未能进入固定相，就被流动相推向前进，发生分子超前,而有些溶质分子在固定相中未能分布平衡并解吸进入流动相,发生分子滞后。这样的超前和滞后都会引起色谱峰的扩展。,涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响“x”号表示被分离组分的分子 a原始样品带宽b、c、d及e分别为经涡流扩散及各阻抗展宽后的谱带宽度,涡流扩散项(A),纵向扩散项(B/u),固定相传质项,流动相传质项,(传质阻力项Cu),在上述方程中,u对纵向扩散项和传质阻力项的影响不一致,因此，可通过求解微分方程得到最佳值：,HPLC和GC的H-u图比较,LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多(以板高衡量).LC的板高最低点相应流速比起GC的极值流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速可较小。,LC,GC,更小的颗粒度,van Deemter 曲线带来的承诺,如果填料的颗粒继续演变,Ultra Performance LC速度,(3)影响谱带展宽的其它因素柱外效应:柱前展宽、柱后展宽,2T=2co+2in+2tu+2De+2or,2T 为色谱系统观察到的峰展宽的总方差;等号右边第二项向后各项均为柱外效应展宽,依次为进样(系统和方式)、系统连接管、检测器和其他因素引起的色谱峰展宽.一般要求柱外效应引起的峰展宽总峰展宽的10%.,1.8 分离度方程及分离条件的控制,1.8.1 分离度方程,根据分离度定义和理论塔板数公式及保留方程式可推导出分离度方程:,因:,又:,即,(1),(2),(,),分离度方程,(2)式代入(1)式得:,分子分母再同时除以tR1,得下式:,1.8.2 影响分离度的因素：k、()及N,k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱,即组分在柱上保留能力的大小.希望值:110.是分离因子，决定两个欲分离组分是否能分离,分离程度的大小.希望值:1.052.0(=1,R=0).N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度.k和的大小取决于色谱系统与“物质对”的热力学性质,N(或H)决定于色谱系统的动力学特性.,、k及 N 如何控制分离度,1.8.3 由哪些因素来调节k、及N？,k 与流动相组成(主要是溶剂比例等)、固定相的性质和用量及柱温有关。随流动相组成(特别是有机溶剂种类和pH值等)、固定相的性质及柱温的变化而变。N（或H）由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、填料粒径、流速和温度等操作条件的变化而变。,通过改变流动相组成改变-同样强度的不同溶剂:还可改变色谱柱和柱温(不常用).,改变分离因子 的例子,改变容量因子 k的例子,甲醇/水的比例不同:,理想的k值在110之间,色谱法研究的核心：,选择最适合的色谱体系(用什么色谱分离模式?什么柱?什么流动相?)和分离条件,在最短的时间达到最佳的分离度。,谢 谢！,